Метилен көгүнүн митохондриялык таасирин өлчөө: кычкылтек, ATP жана мембрана потенциалы

Лаборатория дем алуусу бузулган митохондрияларга метилен көгүн кошуп, кычкылтек керектөөсүнүн өскөнүн байкады дейли. Мындайда боёк митохондриянын функциясын калыбына келтирди деп жазуу табигый көрүнөт. Бирок бул сүйлөм туура эмес болушу мүмкүн. Кычкылтек агымы, ATP синтези жана мембрана потенциалы — үч башка түшүнүк. Алар бир органеллада жүрөт, бул камдык көчүрмөлөө, синхрондоштуруу жана бөлүшүү бир эле булут папкасын колдонгонуна окшош: өз ара байланыштуу, бирок ар башка эрежелерге баш иет. Бирин экинчиси менен чаташтырсаңыз, ар бир өлчөө техникалык жактан туура болсо да, чечмелөө жаңылыш болот.

Метилен көгү мындай чаташуунун ыктымалдыгын жогорулатат, анткени ал өзү өлчөп жаткан системага катышат. Ал чынжырдын жогорураак баскычында электрондорду кабыл алып, төмөнүрөөк баскычында берген редокс-циклдөөчү зат, энергияланган митохондрияларда топтолуучу липофилдүү катион жана кеңири колдонулган зонддор менен бирдей спектр тилкелеринде жарыкты сиңирип, чыгаруучу каныккан көк кошулма. Бир эле көрсөткүч булардын баарын камтый албайт. Будапешттеги митохондриялык изилдөөлөрдө көрсөтүлгөн ишенимдүү ыкма — кычкылтек агымын, ATP синтезинин ылдамдыгын, мембрана потенциалын жана суутек пероксидинин бөлүнүшүн бирге өлчөө, ар бир этапта боёкко тиешелүү контролдорду колдонуу.

Респирометрия энергиянын чыгышын эмес, кычкылтек агымын өлчөйт

Oroboros Oxygraph же Seahorse клеткадан тышкаркы агым анализатору менен жүргүзүлгөн жогорку ажыратуу жөндөмүндөгү респирометрия бир гана нерсени көрсөтөт: кычкылтек канчалык тез калыбына келүүдө. Ал ар бир электронго канча протон айдалганын, градиенттин канчасы сакталганын же ATP-синтаза аны колдонгон-колдонбогонун көрсөтпөйт.

Терминология маанилүү. Бөлүнүп алынган митохондрияларда ADP жок субстрат протондордун агып өтүшүнө байланышкан дем алууну, каныктыруучу ADP менен субстрат кычкылдануу аркылуу фосфорлоонун мүмкүнчүлүгүн, ал эми ажыраткычты титрлөө электрон өткөрүүнүн максималдуу мүмкүнчүлүгүн көрсөтөт. Бүтүн клеткаларда Seahorse үчүн алардын эквиваленттери — базалдык дем алуу, олигомицинге сезимтал ATP менен байланышкан дем алуу, протондордун агып өтүшү, FCCP менен аныкталган максималдуу дем алуу жана ротенон менен антимицинге туруктуу митохондриялык эмес кычкылтек керектөөсү. Seahorse көрсөткүчтөрүн 3-абал жана 4-абал деп атоо препарат камсыздай албаган тактыкты таңуулайт; муну Agilent Mito Stress Test ыкмасы айкын көрсөтөт.

Метилен көгү көбүрөөк кычкылтек менен көбүрөөк энергиянын ортосундагы интуитивдүү байланышты бузат. Бөлүнүп алынган мээ митохондриялары боюнча изилдөөгө ылайык, деңиз чочкосунун бөлүнүп алынган мээ митохондрияларында 100 nM ден 1 uM ге чейинки боёк глутамат жана малат, сукцинат жана альфа-глицерофосфат субстраттары менен тынч абалдагы кычкылтек керектөөсүн жогорулаткан. Альфа-глицерофосфатта өсүш болжол менен 64 пайыз болгон, бирок дени сак митохондрияларда ADP менен стимулданган дем алуу дээрлик өзгөргөн эмес. Протондордун агып өтүшүнө байланышкан дем алуу өсүп, ADP менен стимулданган агым өзгөрбөгөндүктөн, эсептелген дем алууну контролдоо катышы төмөндөйт. Бул төмөндөө боёк митохондрияларга зыян келтиргенин билдирбейт. Ал боёк кадимки дем алууга кошумча кычкылтек керектөөчү редокс-циклди кошконун билдирет. Метилен көгүнүн кычкылтек керектөөсүн өлчөгөн анализ өсүштү гана көрсөтсө, ал чыныгы химиялык процессти өлчөгөн болот, бирок энергиянын сакталышы тууралуу эч нерсе айтпайт.

Калыбына келтирүү эксперименттери ушул эле айырманы чоңураак масштабда көрсөтөт. I комплекси бөгөттөлгөндө, кычкылтек агымы болжол менен үч эсе калыбына келген, ал эми ATP синтези болгону 1.5 эсе калыбына келген. Электродго көбүрөөк кычкылтек жеткен. Бирок анын азыраак бөлүгү ATP өндүрүүгө жумшалган. Кычкылдануу аркылуу фосфорлоо жакшырды деген ар кандай билдирүү ATP боюнча маалыматты да талап кылат; аны кычкылтекке карата ATP катышы түрүндө көрсөтүп, бөлүмдөгү кычкылтек кандай эсептелгенин тактоо эң ылайыктуу.

ATP анализдери синтездин ылдамдыгын өлчөйт, аны жалпы өлчөм алмаштыра албайт

ATP анализи башка суроого жооп берет: убакыт бирдигинде канча ATP пайда болот. Бир нече мүнөт бою байкалган жаркырак коңуздун люциферазасынын люминесценциясы же 340 nm де окулган гексокиназа менен глюкоза-6-фосфатдегидрогеназанын байланышкан анализи сыяктуу кинетикалык өлчөө ылдамдыкты берет. Жалпы ATPни бир акыркы чекитте өлчөө анын өлчөмүн берет; бул синтез менен керектөөнүн айырмасын чагылдырат жана өз алдынча кычкылдануу аркылуу фосфорлоо тууралуу аз маалымат берет.

Будапешт тобу аденилаткиназанын активдүүлүгүн басаңдатып, байланышкан ферменттик ыкманы колдонгон. Алар 1 ден 2 uM ге чейинки метилен көгү ротенон жана антимицин менен иштетилген митохондрияларда ATP өндүрүшүн бир аз, бирок статистикалык жактан маанилүү деңгээлде жогорулатарын аныкташкан. Бул чыныгы, бирок жарым-жартылай калыбына келүү. TEGDMA уулуулугу боюнча изилдөө башка моделде ушундай эле жыйынтыкка келген: 5 mM стоматологиялык TEGDMA мономери I комплекси менен байланышкан дем алууну болжол менен 286 дан 28 агым бирдигине чейин кескин төмөндөткөн, ал эми 2 uM боёк аны болжол менен 86 га чейин калыбына келтирген.

Түстүү редокс-кошулма менен иштегенде эки контролду сөзсүз жүргүзүү керек. Биринчиден, өлчөнгөн ATP синтезинин канча бөлүгү ATP-синтазага көз каранды экенин аныктоо үчүн олигомицинди колдонуңуз. Экинчиден, белгилүү өлчөмдөгү ATP, толук реагент курамы жана колдонулган боёктун так концентрациялары менен клеткасыз шартта кошулган ATPнин кайра өлчөнүп чыгышын текшериңиз; жок дегенде 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM жана 2 uM колдонулсун. Боёк чыккан жарыкты сиңириши, сигнал берүүчү ферментти басаңдатышы же реагенттин редокс-химиясын өзгөртүшү мүмкүн. Жалпы люцифераза анализи боюнча колдонмо дал ушундай тоскоолдуктар үчүн биохимиялык кошумча текшерүүлөрдү сунуштайт. Сигналдын өчүрүлүшү адатта жогорку концентрацияларда күчтүүрөөк болгону үчүн эле 1 uM де артефакт жок деп ойлобоңуз.

Мембрана потенциалынын зонддору агымды эмес, боёктун таралышын өлчөйт

Сафранин O, TMRM жана TMRE, родамин 123 жана JC-1 — баары мембранадан өтүүчү катиондор. Алар электрохимиялык тең салмактуулукка ылайык терс заряддуу матриксте топтолот, ошондуктан жалпы флуоресценция зонддун кайда жайгашканы аркылуу потенциалды кыйыр түрдө көрсөтөт. Алардын бири да ATPни же электрон агымын өлчөбөйт.

Ар бир зондго ылайыктуу препарат бар. Сафранин O бөлүнүп алынган митохондрияларга жана мембранасынын өткөрүмдүүлүгү жогорулатылган клеткаларга ылайыктуу. Адатта ал 2 uM чамасында, дүүлүктүрүү толкун узундугу 495 nm ге жакын жана жарык чыгаруу толкун узундугу 585 nm ге жакын шартта колдонулат; зонддун сиңиши жалпы флуоресценцияны өзгөрткөн өчүрүлүү режиминде иштейт. TMRM жана TMRE бүтүн клеткаларга төмөн наномолярдык жүктөөдө, өчүрүлбөгөн режимде ылайыктуу: деполяризация боёкту бошотуп, митохондриялык флуоресценция төмөндөйт. Жогорку жүктөөдө өзүн-өзү өчүрүүнүн айынан сигналдын багыты тескерисине өзгөрүшү мүмкүн. JC-1 ыңгайлуу жашыл-кызыл катышын берет, бирок жүктөөгө жана митохондриялардын жалпы массасына көз каранды болгондуктан, кылдат контролдонгон TMRMге караганда сандык иштерге анча ылайыктуу эмес. Бул артыкчылыктар менен чектөөлөр кеңири колдонулган митохондриялык мембрана потенциалынын зонддору боюнча обзордо жыйынтыкталган.

Метилен көгү дал иштөө концентрацияларында оптикалык тоскоолдук жаратат. Анын 600 дөн 665 nm ге жакын сиңирүү тилкелери кызыл зонддордун жарык чыгаруусу менен дал келет, ошондуктан ички чыпка эффекттери, флуоресценциянын өчүрүлүшү жана дүүлүктүрүүчү жарыктын сиңирилиши мүмкүн. Боёк өзү дагы экинчи липофилдүү катион болуп саналат жана анын таралышы өлчөнүп жаткан потенциалга жараша өзгөрөт. Коргонуу жолу — кайталама ыкмалар жана бош контролдор: зонд өзүнчө, боёк өзүнчө, зонд боёктун ар бир концентрациясы менен, нөлдүк эталон катары FCCP менен толук деполяризация жана мүмкүн болсо оптикалык жактан айырмаланган экинчи зонд. III комплексин айланып өтүү боюнча изилдөө буга үлгү болгон: антимицин жана миксотиазол менен бөгөттөөдөн кийин мембрана потенциалынын калыбына келишин сафранин O менен да, TMRM менен да кайталап өлчөп, бирдей сапаттык калыбына келүүнү алышкан. Бир оптикалык сигнал берүүчү — ишарат. Эки көз карандысыз сигнал берүүчү — далил.

Үч препарат, үч башка суроо

Бөлүнүп алынган митохондриялар, мембранасынын өткөрүмдүүлүгү жогорулатылган клеткалар жана бүтүн клеткалар бир анализдин өз ара алмаштырыла турган сезгичтик жөндөөлөрү эмес. Алар иштөө принциптери ар башка болгон өзүнчө түшүнүктөр.

Бөлүнүп алынган митохондрияларда электрон ташуу чынжыры, ички мембрана жана матрикстин молекулалык аппараты сакталат, ал эми плазмалык мембрана, цитозоль жана тармактык түзүлүш алынып салынат. Мындай алып салуунун максаты да ушул: субстраттар, ADP, ингибиторлор жана боёктун концентрациялары так аныкталып, кайсы жол иштеп жатканын белгилөөгө болот. Мунун баасы — табигый субстрат камсыздоосунун, сигналдашуунун жана энергияга болгон талаптын жоголушу.

Мембранасынын өткөрүмдүүлүгү жогорулатылган клеткаларда митохондриялар клеткалык түзүлүшүнүн көп бөлүгүнүн ичинде сакталат, ошол эле учурда сырттан берилген субстраттар менен ADP ачылган плазмалык мембранадан өтөт. Алар клеткалык чөйрөдө субстратты пайдалануу жолунун бузулушун аныктоого туура келет. Өткөрүмдүүлүктү ашыкча жогорулатуу сырткы мембрананы жабыркатат, ал эми цитозолдук жөнгө салуу жуулуп кетет.

Бүтүн клеткаларда баары сакталат: плазмалык мембрананын тосмосу, цитозолдук калыбына келтиргичтер, эндогендик субстраттардын ташылышы, митохондриялык тармак жана ATPге болгон талап. Алар физиологияга эң жакын, механизмди ажыратып аныктоого эң алыс, анткени боёктун сиңиши, калыбына келиши жана обочолонуп топтолушу митохондрияларга иш жүзүндө жеткен таасирди бирге аныктайт.

TEGDMA изилдөөсүндө үч деңгээл тең атайын колдонулган: кычкылдануу менен потенциалдын боёк аркылуу калыбына келишин изилдөө үчүн бөлүнүп алынган мээ митохондриялары; бузулууну негизинен I комплекси менен байланышкан субстраттын кычкылдануусуна таандык кылуу үчүн мембранасынын өткөрүмдүүлүгү жогорулатылган тиш пульпасынын өзөк клеткалары; ал эми басаңдаган кычкылтек керектөөсүнө 2 uM боёктун физиологиялык жалпы таасирин баалоо үчүн бүтүн өзөк клеткалар. Ар башка препараттардагы митохондриялык көрсөткүчтөрдү салыштырган окурмандар үчүн метилен көгүнүн электрондорду дем алуу чынжыры аркылуу кантип өткөрөрү тууралуу коштоочу түшүндүрмө жолдун негизин берет, ал эми метилен көгү менен дем алууну изилдеген иштерди окуу боюнча колдонмо концентрация жана ингибиторлордун логикасын түшүндүрөт.

Редокс-активдүү боёк талап кылган контролдор

Редокс-циклдөөчү зат кадимки ингибиторго караганда узунураак контролдор тизмесин талап кылат, анткени боёктун өзүнүн химиясы биологиялык процессти туурагандай көрүнүшү мүмкүн.

Респирометрия үчүн көрсөткүчтүн убакыт боюнча жылышын текшерүүгө буфери гана бар камераны, биологиялык материалсыз буфер жана боёк бар камераны, боёк менен анализде бар болгон ар кандай клеткадан тышкаркы калыбына келтиргичти, ошондой эле бүтүн клеткалардагы митохондриялык эмес кычкылтек керектөөсүн аныктоо үчүн акыркы этапта ротенон менен антимицинди колдонуңуз. Калыбына келген боёк электрондорду кычкылтекке өткөрүп, суутек пероксидин түзүү менен кайра кычкылданарын эске алыңыз. Ошондуктан электрон донору жок, боёк гана камтылган бош контроль NADH же NADPH пайда болгондо клеткасыз шартта жүргөн кычкылтек керектөөсүн төмөн баалайт.

Суутек пероксиди үчүн тандалма эмес DCFDA боёкторунун ордуна калибрленген Amplex UltraRed менен хрен пероксидазасын тандаңыз, каталаза менен текшериңиз жана жарыктандырууга көз карандылыкты сынаңыз, анткени боёк фотосенсибилизатор болуп саналат. Мээ митохондриялары боюнча изилдөөдө болгону 100 nM боёкто пероксид жүгү төрт эседен ашык өскөнү, ошол эле учурда аны жок кылуу жайлаганы аныкталган; пероксид супероксиддик аралык баскычсыз, калыбына келген боёктон түз пайда болгон. Зонд тандоо жана жарыкты контролдоо боюнча кеңири маалымат боёк менен жүргүзүлгөн эксперименттерде кычкылтектин реактивдүү түрлөрүн өлчөө тууралуу коштоочу макалада берилет. Ал эми пероксид качан сигнал, качан ашыкча жүк катары иштейт деген кеңири суроо клеткалык редокс-тең салмактуулук жана антиоксиданттык билдирүүлөр менен бирге каралат.

Кайсы жол иштеп жатканы тууралуу тыянак чыгаруу үчүн III комплексинин эки ингибитордук участогун тең сынаңыз: Qi участогунда антимицин Aны жана Qo участогунда миксотиазолду, ошондой эле цианид менен IV комплексине тиешелүү акыркы текшерүүнү. Чычкандын мээси боюнча мурдагы изилдөөдө боёк ротенон бөгөттөгөн дем алууну калыбына келтиргени, бирок антимицин бөгөттөгөн дем алууну калыбына келтирбегени айтылган. Кийинки үч түрдү камтыган изилдөөдө эки ингибитор менен тең жарым-жартылай калыбына келүү жана цитохром cнин түз калыбына келиши тууралуу далил табылган. Айланып өтүү жолун биротоло аныкталган факт катары эмес, жаңы маалыматтарга шайкеш мүмкүнчүлүк катары караңыз, анткени боёктун концентрациясы, ингибитордун таасир этүү участогу, субстраттын абалы жана боёктун таралышы байкалган жолду өзгөртөт.

Анализ тандоо матрицасы

Бул таблицаны өлчөөгө жараша суроо тандоо үчүн эмес, суроого жараша өлчөө тандоо үчүн колдонуңуз.

Ишенимдүү тыянак үчүн эң аз дегенде боёктун бирдей концентрацияларын — 100 nM, 300 nM, 1 uM жана 2 uM — колдонуп, протондордун агып өтүшү, ADP, олигомицин жана ажыраткыч шарттарында кычкылтек агымын, ATP синтезинин ылдамдыгын, мүмкүн болсо эки зонд менен мембрана потенциалын, ошондой эле каталаза жана клеткасыз контролдор менен калибрленген пероксид бөлүнүшүн өлчөө керек. Өз ара байланышкан көрсөткүчтөр топтомун бериңиз: кычкылтек агымы, ATP ылдамдыгы, кычкылтекке карата ATP, потенциал жана пероксид. Бул сандардын кайсынысы болбосун өзүнчө алганда — мааниси али аныктала элек өлчөө.