Метилен көгү менен жүргүзүлгөн тажрыйбаларда кычкылтектин реактивдүү түрлөрүн өлчөө

Эки лабораториянын ар бири метилен көгүнүн антиоксиданттык таасирин изилдөө деп атаган тажрыйбасын жүргүзөт. Биринчиси боёк кычкылтектин реактивдүү түрлөрүн басаңдатат деп билдирет. Экинчиси аларды пайда кылат деп билдирет. Экөө тең дозага жараша жооптун так ийри сызыктарын көрсөтөт. Экөө тең чынчыл. Айырмачылык алдамчылыкта же компетентсиздикте эмес. Эки топ ар башка жарык шарттарында, ар башка суроолорго жооп берген зонддор менен ар башка нерселерди өлчөп, андан соң эки жоопту тең бир эле сөз менен — ROS деп — сүрөттөгөнүндө.

Метилен көгүн так өлчөө кыйын, анткени ал байкоого тийиш болгон химиялык процесске өзү катышат. Караңгыда ал электрондорду донорлор менен акцепторлордун ортосунда ташып, баштапкы формасына кайтып келет да, циклди кайра баштоого даяр болот. Жарыкта ал фотосенсибилизаторго айланып, козголгон триплеттик абалга өтөт. Бул абалда ал кычкылтекке энергия берип синглеттик кычкылтекти, же электрондорду өткөрүп радикалдар менен суутек пероксидин пайда кыла алат. Бул системага киргизилген ар кандай зондду боёктун өзү кычкылдантып, калыбына келтирип, түсүн өчүрүп же оптикалык жактан жаап коюшу мүмкүн. Ошондуктан ROS көрсөткүчүнө байланыштуу биринчи суроо эч качан сандын канча экендиги эмес. Ал анализ чындыгында эмнени аныктаары жана боёк анализге кандай таасир этери тууралуу болот.

Amplex Red: калибрленген суутек пероксидинин анализи

Метилен көгү менен Amplex Red айкалышы туура уюштурулганда, бул багыттагы адабиятта эң ишенимдүү негизделген айкалыш болуп саналат. Химиясы белгилүү бир затка багытталган: хрен пероксидазасы суутек пероксидин колдонуп, Amplex субстратын болжол менен бирге бир стехиометриялык катышта флуоресценттүү продукт — резоруфинге чейин кычкылдантат. Үлгүдөгү пероксид детектордо флуоресценцияга айланат. ROS тобунун кеңири кабыл алынган башка мүчөлөрүнүн эч бири бул реакцияны түздөн-түз жүргүзбөйт.

Чечүүчү артыкчылык — калибрлөө. Кылдат изилдөөчү ошол эле буферде, пероксидаза менен субстраттын ошол эле концентрацияларында, ошол эле инкубация убактысында жана оптикалык жөндөөлөрдө пероксиддин белгилүү стандарттарын текшерет, андан соң үлгүлөрдүн көрсөткүчтөрүн алынган ийри сызыкка салыштырат. Бул ыкманын негизин түзгөн, мээден бөлүнүп алынган митохондриялар боюнча изилдөөдө авторлор дал ушундай кылышкан: ар бир өлчөө сериясынын аягында белгилүү өлчөмдөгү пероксидди кошушкан. Натыйжалар шарттуу флуоресценция бирдиктери менен эмес, бир миллиграмм белокко мүнөтүнө пикомоль түрүндөгү ылдамдык катары берилген. Жарык чыгарууну өлчөөгө айланткан нерсе — ушул.

Ал изилдөөнүн үч деталын үлгү катары алууга болот. Биринчиден, авторлор сигналды пероксидди ажыратуучу каталаза менен текшеришкен. Каталаза кошулганда метилен көгү жараткан флуоресценциянын өсүшү токтогон. Бул сигнал оптикалык артефакт эмес, пероксид экенин тастыктаган. Экинчиден, алар козгоочу нурду тоскуч менен жаап, үлгүлөргө кадимки жарык дозасынын сегизден бирин гана берүү аркылуу жарыктын таасирин түздөн-түз текшеришкен; сигнал болгону тогуз пайызга төмөндөгөн. Алар билдирген пероксиддин токсон пайыздан ашыгы өлчөө жарыгынан көз каранды эмес болгон. Үчүнчүдөн, алар пероксиддин жоюлушун электрод менен өзүнчө өлчөп, боёк анын пайда болушун көбөйтөрүн да, жоюлушун жайлатарын да аныкташкан. Жалпы флуоресценцияны гана көрсөткөн зонд бул эки таасирди бири-биринен ажырата алмак эмес.

Ошентсе да анализде жаңылыштык жаратуучу жагдайлар бар, ал эми метилен көгү алардын бир нечесин ишке чыгарат. Боёк резоруфин жарык чыгарган ошол эле кызыл аймакта кеңири жутууга ээ. Ошондуктан боёктун жогорку концентрацияларында үлгү ички чыпка эффекттери аркылуу өз сигналын жаап коюшу мүмкүн. Демек, стандарттарда боёктун концентрациясы үлгүлөрдөгүдөй болушу керек. Amplex Red өз алдынча да фотокычкылдана алат, ал эми анын продукты резоруфин супероксид менен пероксидди пайда кылган фоторедокс циклине катыша алат. Тажрыйбада фотосенсибилизатор да жарыктандырылып жатса, бул өзгөчө маанилүү. Практикалык чечим — боёк менен зондду чогуу жарыктандыруунун ордуна, адегенде метилен көгү бар үлгүлөрдү нурлантып, андан соң алардын аликвоталарын Amplex реагенттери менен караңгыда анализдөө. Акырында, супероксиддисмутаза Amplex сигналын жөн гана басаңдатпайт: супероксиддин пероксидге айланышы сигналды күчөтүшү мүмкүн. Флуоресценцияны көбөйткөн SOD көзөмөлү ишке ашпай калган эмес. Ал супероксидди реакция чынжырынын мурунку баскычындагы түр катары аныктаган.

DCFDA: спецификалуу эмес кычкылдануу индикатору

Метилен көгү менен DCFDA айкалышы түшүнбөстүктөрдүн көбүнүн булагы болуп саналат. DCFH-DA — клеткага киргизилүүчү прекурсор. Клетка ичиндеги эстеразалар анын ацетат топторун алып салып, флуоресценция бербеген DCFH калтырат; DCFH кычкылданганда флуоресценттүү DCF пайда болот. Аны кычкылданта турган заттардын тизмеси узун: гидроксил радикалдары, пероксидаза жана гемдин аралык продуктулары, азот диоксиди, гипохлорлуу кислота жана пероксинитриттен келип чыккан радикалдар. Суутек пероксиди жалгыз өзү аны практикалык жактан маанилүү ылдамдыкта түздөн-түз кычкылдантпайт; пероксидге көз каранды флуоресценция үчүн реакция чынжырында адатта темир, гем белоктору же пероксидазалык химия керек.

Ар бир ыкмалар бөлүмүндө шилтеме берилүүгө тийиш болгон сын Калянараман жана кесиптештеринин DCFH зондун талдоосунан келип чыгат. Ал ушул себептен DCFDAдан баш тарткан мээ митохондриялары боюнча изилдөөдө жалпыланган. Бул талдоо зонд жай реакцияга кирерин, стехиометриясы мүнөздөлбөгөнүн, жарактуу калибрлөөсү жок экенин жана ROSко кирбеген кошулмалар менен да реакцияга кирерин көрсөткөн. Зонд өлчөп жаткан процессти өзү да күчөтөт: DCFHтин бир электрондук кычкылданышы DCF радикалын пайда кылат; ал кычкылтек менен реакцияга кирип супероксид түзөт, ал болсо дисмутацияланып кошумча пероксидди пайда кылат. Көрсөткүч өзү билдирген химиялык процессти жарым-жартылай өзү жаратат.

Мунун эч бири DCFDAны пайдасыз кылбайт. Бул аны так аныктоо каражаты эмес, скрининг каражаты кылат. DCF флуоресценциясынын өсүшү зонддун кычкылдантуучуларга көз каранды кычкылданышы көбөйгөнүн билдирет. Бул пероксид көбөйдү дегенди билдирбейт жана жалпы ROS көбөйдү дегенди такыр билдирбейт: мындай жалпы көлөмдү бир дагы зонд жалгыз өлчөбөйт. Метилен көгү боюнча мурунку иштер бир микромолярдан жогору концентрацияларда DCF кычкылданышына таянып, прооксиданттык таасирлерди билдиришкен. Ошол эле мезгилдеги башка системаларда болсо пероксид жараткан клетка өлүмүнөн коргоо байкалган. Ар башка редокс шарттарында бир эле боёк үчүн эки байкоо тең туура болушу мүмкүн, ал эми DCF натыйжасы жалгыз өзү сигналды кайсы кычкылдантуучу жаратканын айта албайт. Мээ митохондриялары боюнча мурунку иштин мааниси — ал бул скринингди пероксиддин калибрленген өлчөөсүнө алмаштырып, пероксид жүгүн түздөн-түз аныктаганында: боёктун жүз наномоляр концентрациясы да текшерилген бардык субстраттарда жана дем алуу абалдарында пероксиддин бөлүнүп чыгышын бир нече эсе көбөйткөн.

DCFDAда метилен көгүнө өзгөчө байланыштуу дагы бир тузак бар. Боёктун түсү өтө күчтүү жана ал редокс-активдүү болгондуктан, флуоресценцияны өчүрүп, жарык чыгарууну басаңдатып же клеткалык ROSко көз карандысыз түрдө зондду кычкылданта алат. Боёк менен зонд бар, бирок клеткалар жок көзөмөл — жөн гана кошумча жасалга эмес. Боёк зонд менен өз ара аракеттенеби же жокпу, ошону айтып берген тажрыйба — ушул.

Спиндик кармоо жана кычкылтектин керектелиши: түрдү аныктоо жана агым

Флуоресценттүү зонддор кычкылданууга жөндөмдүү кандайдыр бир зат пайда болгонун билдирсе, спиндик кармагычтар колдонулган электрондук спиндик резонанс анын эмне болгонун аныктоого жакыныраак маалымат берет. Метилен көгүнүн фотохимиясы боюнча классикалык изилдөө боёк, аскорбат жана жарык катышкан шартта аскорбат радикалын аныктоо үчүн ESR колдонгон. Андан соң кычкылтектин керектелишин өлчөгөн тажрыйбаларда пероксиддин, ал эми спиндик кармоо тажрыйбаларында темир катализдеген гидроксил радикалынын пайда болушун көрсөткөн. Ар бир ыкма башкалары жооп бере албаган суроого жооп берген: ESR радикалдын түрүн аныктаган, кычкылтектин керектелиши флуоресценттүү зонддордон көз карандысыз реакция агымын көрсөткөн, ал эми алардын айкалышы бир эле жарыктандырылган системада синглеттик кычкылтек жолу да, радикалдык жолдор да иштеп жатканын көрсөткөн.

1984-жылдагы бул натыйжа азыр да эскертүү сыяктуу кабыл алынат. Жарык жана калыбына келтирүүчү зат бар кезде боёк пероксидди пайда кылган, ал эми темир бар кезде система бул топтогу эң реактивдүү түр — гидроксил радикалын түзгөн. Авторлор муну көздөгү аскорбат менен байланыштырып, офтальмологияда боёкту ойлонбой колдонууга шек келтиришкен. Азыркы окурмандар шарттарды эске алышы керек: жарык, калыбына келтирүүчү зат жана темир. Булардын бирин алып салсаңыз, реакция жолу алсырайт же жоголот.

Кычкылтек электроддорунун мааниси башкада. Кларк тибиндеги электрод кычкылтектин таза керектелишин өлчөйт. Бул боёк иштеткен редокс химиясы молекулалык кычкылтекти керектеп жатканын көрсөтөт жана эч кандай флуоресценция артефакты бурмалай албаган кинетикалык маалымат берет. Бирок ал продуктунун түрүн аныктабайт. Пероксиддин, супероксиддин жана суунун пайда болушу, ошондой эле синглеттик кычкылтектин ажырашы кычкылтек керектеген процесстерге кирет. Түрү аныкталбаган агым да, агымы өлчөнбөгөн түрдү аныктоо да толук маалымат бербейт. Ошондуктан күчтүү изилдөөлөр электродду калибрленген пероксид анализи же кармагыч менен айкалыштырат.

Антиоксиданттык натыйжалар эмне үчүн карама-каршы келет

Үч көрсөткүчтү катар салыштырганда, метилен көгү тууралуу адабияттагы көрүнгөн карама-каршылыктар ыкмалардын айырмачылыктарына жана үч биологиялык фактыга барып такалат.

Биринчиден, боёк электрон ташуучу да, пероксиддин булагы да болуп саналат. Ал электрондорду кычкылтек болбосо супероксидге айлана турган дем алуу чынжырынын участокторунан башка жакка багыттап, ROSтун бир түрүн азайта алат. Ошол эле учурда анын калыбына келген формасы кычкылтекти түздөн-түз пероксидге чейин калыбына келтирип, башка түрүн көбөйтөт. Ошондуктан митохондриялык редокс химиясын жана метилен көгүнүн айланып өтүүчү жолдогу ролун изилдеген лаборатория зондго көз каранды жоопторду күтүшү керек: бир эле кюветада супероксидге сезгич көрсөткүч төмөндөп, пероксид көрсөткүчү жогорулашы мүмкүн.

Экинчиден, аз дозадагы пероксид зыяндын гана эмес, сигналдын да ролун аткарат. Мурунку иштин уландысы болгон чычкандын мээ митохондриялары боюнча изилдөө боёктун элүү наномолярдай аз концентрациясында пероксид пайда болорун, ал эми терапиялык деңгээлдерде митохондриялык ДНК жабыркабаганын аныктаган. Алдын ала иштетүүдөн кийин ротенон жараткан жабыркоолордон коргоо да байкалган. Терапиялык диапазондон кыйла жогору болгон жүз микромоляр концентрацияда гана боёк айрым ДНК фрагменттерин жабыркаткан. Ал эми кызыл жарык менен жыйырма микромоляр боёктун айкалышы текшерилген бардык фрагменттерди жабыркаткан синглеттик кычкылтекти пайда кылган. Сунушталган механизм гормезиске негизделет: пероксиддин аз өлчөмдө пайда болушу Nrf2 менен байланышкан антиоксиданттык коргонуу механизмдерин жана митохондриялык биогенезди иштетет. Ошентип, кыска мөөнөттөгү прооксиданттык көрсөткүч узак мөөнөттөгү антиоксиданттык натыйжадан мурда байкалат. Бир сааттан кийин окулган анализ менен бир күндөн кийин окулган анализдин натыйжалары айырмаланышы мүмкүн, анткени алардын ортосунда биологиялык абал өзгөргөн.

Үчүнчүдөн, жарык кайсы молекула бар экенин да аныктайт. Жарыктандыруу боёкту деметилдеп, Azure B жана ага жакын продуктуларга айлантат; идиштин үстүндөгү микроскоп лампасы эле аны фотосенсибилдештирүүгө жетиштүү. Караңгыда жана жарыкта жүргүзүлгөн тажрыйбалар — ар башка тажрыйбалар. Ошондуктан ар бир протоколдун жарыктандырууну жана боёк менен иштөөнү көзөмөлдөө бөлүмү аларды ушундай карашы керек.

Көзөмөлдөрдүн минималдуу топтому жана билдирүүлөрдү чечмелөө

Төмөнкү салыштыруу — бул макала үчүн түзүлгөн маалымдама материал. Метилен көгүнө байланыштуу кандайдыр бир ROS натыйжасын кабыл алардан мурун, авторлор кайсы саптагы көзөмөлдү аткарганын жана кайсынысын өткөрүп жибергенин текшериңиз.

Мындан практикалык чечмелөө эрежеси келип чыгат. Пероксидаза менен колдонулган, калибрленген жана каталаза менен текшерилген Amplex пероксид тууралуу далил берет. DCFDA зонддун спецификалуу эмес кычкылданышы тууралуу гана далил берет, андан ашык эмес. Радикалдарды кармап жок кылуучу заттар колдонулган көзөмөлдөр менен бирге жүргүзүлгөн спиндик кармоо радикалдын түрү тууралуу далил берет. Кычкылтектин керектелиши агым тууралуу далил берет. Анализи негиздей алгандан көбүрөөк нерсени ырастаган сүйлөм, канчалык ишенимдүү жазылбасын, боёк тууралуу эмес, зонд тууралуу сүйлөм болот. Дозага көз карандылык жана гормезис диапазону, митохондриялык электрон агымы, боёлгон үлгүлөрдөгү анализге тоскоолдуктар жана микроскопиядагы жарыктандыруу артефакттары тууралуу байланышкан талкуулар бул ойлордун ар бирин кеңейтет; убактылуу шилтемеси алмаштырылгандан кийин да алардын ар бири күчүндө калат.