Метилен көгү менен жөнөкөй боёо жана Грам боюнча боёо: ар бир ыкма эмнени далилдей алат

Студент E. coli деп белгиленген культурадан сүртүндү даярдап, үстүнө бир мүнөткө метилен көгүн куюп, жууп, май иммерсиялык объектив аркылуу карайт. Көрүү талаасы көк таякчаларга толгон. Лабораториялык отчетто: «E. coli катары аныкталган Грам-терс таякчалар» деп жазылган. Байкоо туура. Бирок бул препарат мындай тыянак чыгарууга негиз бербейт.

Ката техникалык эмес, түшүнүккө байланыштуу. Студент жөнөкөй боёону дифференциалдык сыноо катары кабыл алган. Жөнөкөй боёо менен Грам боюнча боёо ар башка суроолорго жооп берет, анткени алардын боёо принциптери ар башка. Биринчиси: кандай форма бар деген суроону берет. Экинчиси: сыноо шартында клетка дубалы өзүн кандай алып жүрөт деген суроону берет. Экөөнү чаташтырсаңыз, туура боёлгон препараттын негизинде далилсиз отчет түзүлөт.

Бул салыштыруу эки ыкманы өз-өзүнчө карап, ар бир жыйынтык кандай тыянак чыгарууга негиз берерин көрсөтөт жана студенттер эң көп берген эки суроого жооп берет: метилен көгүн Грам боюнча боёодо колдонсо болобу жана E. coli клеткаларын метилен көгү менен боёо чындыгында эмнени көрсөтөт.

Кыскача жооп

Метилен көгү менен жөнөкөй боёодо боёкту кабыл алган бардык клеткалар бирдей көк түскө боёлот. Ошондуктан ал морфологияны (таякчалар, шарлар, спиралдар) жана жайгашууну (жалгыз, жуп, чынжыр) көрсөтөт, бирок Грам категориясы жөнүндө маалымат бербейт. Грам боюнча боёодо йод, түссүздөндүрүү этабы жана контрасттык боёк кошулат. Ошентип, бактериялардын клетка кабыкчалары боёкту кантип кармап калганына жараша Грам-оң (кызгылт көк) жана Грам-терс (кызгылт же кызыл) болуп бөлүнөт. Метилен көгүнөн кийинки көк таякчалар «таякча сымал клеткалар бар» дегенди билдирет. Грам боюнча толук боёодон кийинки кызгылт таякчалар «Грам-терс таякчалар бар» дегенди билдирет. Экинчи билдирүү көбүрөөк негизделген, анткени процедурада кошумча сыноо жүргүзүлгөн.

Бул макалада каралган ыкма кирген бактерияларды бир боёк менен боёо ыкмаларынын кеңири тобу жөнүндө микроскопиялык боёо атласынан караңыз.

Жөнөкөй боёо: бир боёк, бир суроо

Метилен көгү — негиздик (катиондук) боёк. Анын түстүү иону оң зарядга ээ жана клеткадагы терс заряддуу түзүлүштөргө, анын ичинде нуклеин кислоталарына жана беттеги кислоталуу топторго байланышат. Ошондуктан клеткалар агыш фондо көк болуп көрүнөт. OpenStax боёо тууралуу бөлүмүндө ушул позитивдүү боёо принцибин түшүндүрөт. Боёктун катиону — метилен көгүнүн химиясы боюнча маалымдамада кеңири сүрөттөлгөн кичинекей жалпак фенотиазин иону; хлорид каршы иону түс бербейт.

Стандарттык окуу протоколу атайын жөнөкөйлөтүлгөн: жука сүртүндү даярдоо, абада кургатуу, ысытуу менен бекитүү, үстүнө болжол менен 1% суудагы метилен көгүнүн эритмесин болжол менен бир мүнөткө куюу, суу менен акырын жуу, соргуч кагаз менен кургатуу жана май иммерсиясы менен кароо. LibreTexts окуу протоколунда дал ушул 1% эритме менен бир мүнөт боёо тартиби берилген, ошол эле учурда айрым лабораторияларда убакыт узартылары белгиленет. Боёкту бекиткич да, түссүздөндүргүч да, экинчи боёк да жок. Негизги өзгөчөлүк ушунда. Бир гана боёк колдонулуп, ал тандалма түрдө кетирилбегендиктен, боёкту байланыштырган ар бир клетка бирдей түскө ээ болот.

E. coli үчүн күтүлгөн көрүнүш — жалгыз, жуп же чакан топтор менен жайгашкан көк таякчалар (бациллалар). Көк түс боёктон келип чыгат. Таякча формасы организмге таандык. Бирок бул эки белги организмди аныктабайт, анткени көптөгөн түрлөр таякча сымал болот жана көптөгөн таякчалар жөнөкөй боёодо көк түскө боёлот. ATCC микробиологиялык культуралар боюнча колдонмосунда бул ыкма морфология менен гана чектелерин ачык көрсөтөт. Туура отчетто: «көк бациллалар байкалды» деп жазылат. Форма менен жайгашуудан башка тыянак үчүн кошумча далил керек.

Грам боюнча боёо: төрт реагент, бир касиетти текшерүү

Грам боюнча боёо — дифференциалдык боёо. Бардык клеткалар бирдей этаптардан өтөт жана кайсылары биринчи боёкту кармап калары, кайсылары аны жоготору байкалат. Америкалык микробиология коомунун Грам боюнча боёо протоколдору стандарттык төрт этаптын тартибин аныктайт: кристаллдык кызгылт көк (негизги боёк), Грам йоду (боёкту бекиткич), спирт же ацетон-спирт аралашмасы (түссүздөндүргүч), андан кийин сафранин (контрасттык боёк).

Стандарттык окуу модели бул айырманы клетка кабыкчасынын түзүлүшү менен түшүндүрөт. Грам-оң клеткалардын калың пептидогликан дубалы спирт менен жууганда суусузданып, кристаллдык кызгылт көк–йод комплексин кармап калат. Грам-терс клеткаларда жука пептидогликан катмары жана липиддерге бай сырткы мембрана бар. Түссүздөндүргүч бул мембрананы бузгандыктан, комплекс жуулуп кетет да, клеткалар андан кийин сафранинди кабыл алат. NCBI Bookshelf порталындагы Грам боюнча боёо серептөөсү клетка дубалына байланышкан ушул түшүндүрмөнү берет. Адистер толук физика-химиялык механизм дубалдын калыңдыгынан гана көз каранды эмес, кыйла татаал экенин белгилешет. Бирок лабораторияда чечмелөө үчүн бул эреже жарактуу: кызгылт көк түс — боёк кармалып калганын, кызгылт түс — биринчи боёк жоголуп, андан кийин контрасттык боёк менен боёлгонун билдирет.

Түшүндүрмө сүрөттөр. Ыкмаларды салыштыруу үчүн стилдештирилген чиймелер, камера менен тартылган микрофотографиялар эмес. Түстөр ыкманын логикасын үйрөтүү үчүн жөнөкөйлөтүлгөн: жөнөкөй боёодо бир түс, Грам боюнча түссүздөндүрүүдөн кийин эки түс.

Метилен көгүн Грам боюнча боёодо колдонсо болобу

Бул суроону эки түрдүү түшүнсө болот жана аларга ар башка жооп керек.

Биринчи мааниси: метилен көгүн бир жолу куюу Грам боюнча боёонун бардык этаптарын алмаштыра алабы? Жок. Йод, түссүздөндүргүч жана контрасттык боёк болбосо, дифференциалдык этап жүргүзүлбөйт, демек Грам категориясы текшерилбейт. Метилен көгү гана колдонулгандан кийинки көк көрүү талаасы — бөтөлкө Грам реагенттеринин жанында турса да — жөнөкөй боёонун жыйынтыгы. Аны Грам боюнча боёонун жыйынтыгы катары жазбаңыз.

Экинчи мааниси: метилен көгү 4-этапта контрасттык боёк катары сафранинди алмаштыра алабы? Функциялык жактан ал түссүздөнгөн клеткаларды боёй алат жана окуу китебиндеги көнүгүү мындай алмаштыруудан кийин Грам-оң клеткалар кызгылт көк, ал эми Грам-терс клеткалар көк болорун болжолдойт. Бул логика туура, анткени талаптагыдай түссүздөнгөн Грам-терс клеткалар дээрлик түссүз болот жана башка катиондук боёкту кабыл алат. Бирок бул стандарттык протокол эмес. ASM протоколдорунда сафранин көрсөтүлгөн; айрым варианттарында негиздик фуксин сыяктуу таанылган альтернативалар бар, бирок метилен көгү көрсөтүлгөн эмес. Практикалык кемчилиги да бар: көк түстү кызгылт көк түстөн айырмалоо кызгылт түстү кызгылт көк түстөн айырмалоого караганда кыйыныраак, өзгөчө жаңы үйрөнүп жаткандар үчүн жана микроскоптун жарыгы начарлаганда. Окуу иштеринде жана жыйынтыгы маанилүү болгон бардык учурларда протоколуңузда көрсөтүлгөн контрасттык боёкту, адатта сафранинди, колдонуңуз. Метилен көгүн контрасттык боёк катары колдонууну стандартка тең ыкма эмес, көрсөтмөлүү вариант катары караңыз.

Метилен көгүн бир боёктуу башка варианттар менен салыштыруу маселеси бактерияларды жөнөкөй боёо ыкмаларын салыштырган материалда каралат.

E. coli клеткаларын метилен көгү менен боёо эмнени далилдейт, эмнени далилдебейт

E. coli — Грам-терс таякча, бирок бул сүйлөм бир нече ыкмадан алынган фактыларды бириктирет: морфология микроскопиядан, Грам реакциясы Грам боюнча боёодон, ал эми түрдүн аныкталышы культураны изилдөө жана биохимиялык же молекулалык сыноолордон алынат. Метилен көгү менен боёлгон сүртүндү биринчи бөлүгүн гана берет. Ал боёлгон үлгүдө таякча сымал клеткалар бар экенин жана алардын кандай жайгашканын аныктайт. Ал Грам реакциясын аныктабайт, анткени түссүздөндүрүү сыноосу жүргүзүлгөн эмес. Ал түрдү да аныктабайт, анткени мындай ажыратуу жөндөмүндө көптөгөн түрлөрдүн таякчалары окшош көрүнөт.

Дал ушул жерде отчеттордо күтүлгөндөй ката кетет. Автор алдын ала билген маалыматты («бул культура E. coli болушу керек, ал эми E. coli — Грам-терс») байкоо жазылган сапка кошот. Натыйжада препарат чындыгында болжолдонгон нерсени ырастагандай көрүнөт. Так отчет маалыматтын катмарларын бөлүп көрсөтөт: «Метилен көгү менен жөнөкөй боёо: көк бациллалар байкалды; морфология гана, Грам категориясы текшерилген жок». Андан соң, эгер Грам боюнча боёо контролдор менен туура жүргүзүлсө: «Грам боюнча боёо: кызгылт таякчалар, Грам-терс реакцияга шайкеш». Түрдү аныктоо кийинчерээк, идентификациялоо ишинин жүрүшүндө жүргүзүлөт, жалгыз түскө негизделбейт.

Жыйынтыкты чечмелөө боюнча практикалык колдонмо

Лабораторияда ушул чечим эрежесин колдонуңуз. Эгер бардык клеткалар бир түстө болсо жана протоколдо түссүздөндүргүчсүз бир боёк колдонулса, сиз жөнөкөй боёо жүргүзгөнсүз. Форманы, болжолдуу өлчөмдү жана жайгашууну жазыңыз. Ушуну менен чектелиңиз. Эгер протоколдо кристаллдык кызгылт көк, йод, түссүздөндүргүч жана контрасттык боёк белгилүү оң жана терс контролдор менен колдонулса, сиз Грам боюнча боёо жүргүзгөнсүз. Түсүн жана морфологиясын бирге жазыңыз: чынжыр болуп жайгашкан кызгылт көк кокктор, кызгылт таякчалар жана башка.

Түшүнбөстүктөрдүн көбүнө үч ката себеп болот. Биринчиси — көк таякчаларды E. coli экенинин ырастоосу катары ашыкча чечмелөө. Экинчиси — метилен көгү менен боёлгон препаратты дептерде «Грам боюнча боёо» деген аталыштын алдына жазуу; муну кийин окугандар туура эмес түшүнөт. Үчүнчүсү — контрасттык боёкторду ойлонбой алмаштырып, андан соң лабораториялардын түстөрүн алардын түс топтомдору бирдей болгондой салыштыруу. Ар бир катанын чечими бирдей: чындап колдонулган ыкманы атаңыз жана ошол ыкма текшерген нерсе жөнүндө гана тыянак чыгарыңыз.

Жөнөкөй боёо аз гана нерсени аныктаганы үчүн өз ордун табат. Ал тез, майда техникалык каталарга анча сезимтал эмес жана суроо морфологияга байланыштуу болгондо жетиштүү: бир нерсе барбы жана анын формасы кандай? Суроо классификация жөнүндө болсо, дифференциалдык сыноо жүргүзүңүз. Көк препарат клеткалардын кандай көрүнөрүн көрсөтөт. Кызгылт көк же кызгылт препарат алардын дубалдарынын сыноодо өзүн кандай алып жүрөрүн көрсөтөт. Эки препараттын бири да өз алдынча түрдү аныктабайт.