Эмне үчүн метилен көгү кислотага туруктуулукту аныктоочу боёодо контрасттык боёк катары колдонулат

Лаборант боёонун бардык баскычтары аяктагандан кийин какырыктын сүртүндүсүн карайт. Көк фондо кызыл таякчалар даана көрүнүп, корутундуда кислотага туруктуу бациллалар байкалганы жазылат. Эртеси башка предметтик айнекте кызыл таякчалары жок, бир калыптагы көк фон көрүнүп, анын жыйынтыгы кургак учукка терс деп берилет. Бул эки корутундунун бири айнектеги көрүнүш тастыктагандан ашыкча тыянак чыгарат — ал биринчиси эмес.

Бул жаңылыштык түшүнүктөн келип чыгат. Лаборант көк боёкту аныктоонун химиялык механизминин бир бөлүгү катары кабыл алып, метилен көгү микобактерияларды табууга жардам берет деп ойлогон. Бирок андай эмес. Метилен көгү предметтик айнекке тийген учурда сыноо эбак аяктаган болот. Боёк жыйынтыкты окууга мүмкүн болушу үчүн фонду гана боёйт. Бул макалада кислотага туруктуулукту аныктоочу боёодо метилен көгүнүн милдети, эмне үчүн башка түс эмес, көк түс колдонулары жана көк фондогу кызыл түс кандай тыянак чыгарууга негиз берери түшүндүрүлөт.

Кыскача жооп

Кислотага туруктуулукту аныктоочу боёо — үч принципке негизделген айырмалоочу сыноо. Негизги боёк болгон карбол-фуксин бардык клеткаларга, анын ичинде мом сымал кабыгы бар микобактерияларга да күчөтүлгөн шартта киргизилет. Түссүздөндүргүч болгон кислота-спирт кадимки клеткалардан кызыл боёкту кетирет, бирок кислотага туруктуу клеткалардан аны чыгара албайт. Андан кийин контрасттык боёк болгон метилен көгү түссүздөндүргүч боёгун кетирген бардык материалды боёйт. Натыйжада кислотага туруктуу эмес клеткалар, организмдин клеткалары жана калдыктар көк болуп көрүнөт, ал эми кислотага туруктуу бациллалар кызыл бойдон калат. Контрасттык боёк контрастты камсыздайт. Ал клетканы кислотага туруктуу кылган химиялык механизмге катышпайт.

Ар бир баскычтын милдети

Төмөнкү схема милдеттердин бөлүштүрүлүшүн көрсөтөт. Аны жол-жобо катары солдон оңго карай окуңуз. Ал эми төмөнкү тилке боёо ыкмаларынын ар бир тобу өзүнчө суроого жооп берерин эске салат.

Биринчи баскыч — боёктун клеткага кириши. Микобактериялардын кабыгы өзгөчө гидрофобдуу болгондуктан, кадимки суудагы боёктор аларга оңой кирбейт. Ошондуктан протокол боёктун киришин күчөтөт. Циль–Нильсен ыкмасында ысытып буулантуу фенол камтыган карбол-фуксиндин мом сымал дубалдан өтүшүнө жардам берет. Киньюндун муздак ыкмасында ысытуунун ордуна кыйла күчтүү негизги боёк курамы колдонулат, ал эми ысытуусуз аткарылуучу айрым өзгөртүлгөн варианттарда беттик-активдүү заттар кошулат. Америкалык микробиология коомунун кислотага туруктуулукту аныктоочу боёо протоколдорунда эки курам катар берилген жана алардын концентрациясынын айырмасы чоң: ысытуу менен аткарылган ыкмада 100 mL үчүн болжол менен 0.3 g негиздик фуксин, ал эми муздак ыкмада болжол менен 4 g колдонулат.

Экинчи баскыч — айырмалоо. Адатта 97 mL 95 пайыздык этанолго 3 mL концентрацияланган туз кислотасы кошулган кислота-спирт дубалы өзгөчө каршылык көрсөтпөгөн ар бир клеткадан кызыл боёкту жууп кетирет. Микобактерияларга мүнөздүү липиддик кабыгы бүтүн клеткалар боёкту кармап калат. Бүтүндөй ыкманын чечүүчү баскычы ушул жана ал аткаруу техникасына эң сезимтал; бул төмөндө талкууланат.

Акыркы баскыч — контраст түзүү. Эми предметтик айнекте боёгу кетирилген клеткалардын дээрлик түссүз фонунда кызыл кислотага туруктуу клеткалар турат. 0.3 пайыз w/v концентрациясындагы метилен көгү бул фонду кызылдан мүмкүн болушунча айырмаланган түскө боёп, кайра көрүнүктүү кылат. Контрасттык боёо кыска убакытка жүргүзүлөт: адатта ысытуу менен аткарылган ыкмада 20дан 30 секундга чейин, ал эми муздак ыкманын айрым варианттарында бир нече мүнөткө чейин. Бул убакыт боёктун өзүнүн касиетине эмес, протоколго жараша болот.

Эмне үчүн ушул боёк жана эмне үчүн көк түс

Метилен көгү — катиондук негиздик боёк. Демек, анын түстүү иону оң заряд алып жүрөт жана түссүздөндүрүлгөн бактериялардын, организмдин клеткаларынын жана калдыктардын терс заряддуу беттерине байланыша алат. OpenStax микробиология окуу китеби заряддардын ушул өз ара аракеттенүүсүн негиздик боёктордун жалпы иштөө принциби катары сүрөттөйт. Бирок бул жагынан метилен көгү химиялык жактан уникалдуу эмес. Кристаллдык кызгылт көк жана сафранин да негиздик боёктор. Тандоо химияга эмес, оптикага негизделет.

Кызыл таякчаларга алардан айырмаланган өңдөгү фон керек, ал эми жарык талаалуу микроскопияда көк түс кызыл менен эң пайдалуу контрастты түзөт. Сафранин начар контрасттык боёк болмок, анткени анын акыркы кызгылт-кызыл түсү сакталып калган карбол-фуксиндин түсүнө өтө жакын болуп, жол-жобо жараткан айырманы жоготмок. Кристаллдык кызгылт көк болсо ичке кызыл бациллалар менен көңүл буруу үчүн атаандашкан кочкул кызгылт көк фон түзмөк. Бул боёктун милдети химиялык таасир эмес, контраст түзүү экенинин эң күчтүү далили — аны алмаштырууга болору: малахит жашылы жана ачык жашыл сыяктуу жашыл контрасттык боёктор айрым ветеринардык жана өзгөртүлгөн протоколдордо колдонулат. Ошондо да сыноо иштейт, анткени ачык айырмаланган каалаган өң ошол эле милдетти аткарат.

Мындан эки практикалык тыянак чыгат. Биринчиден, стандарттык рецептте pH жөнгө салынбайт; бул кадимки 0.3 пайыздык суудагы эритмени Лёффлердин метилен көгү сыяктуу щелочтуу курамдар менен чаташтырбаңыз — алар башка боёо принцибине таандык. Экинчиден, ашыкча боёо зыян келтирет. Гистологиялык адабияттарда өтө коюу көк фон аз сандагы бациллаларды жашырып коюшу мүмкүн экени өзгөчө эскертилет. Ошондуктан предметтик айнекти протокол уруксат бергенден узак убакыт боёкто кармоо эч кандай пайда бербей, көрүнүштүн дааналыгын гана начарлатат.

Сыноону мүмкүн кылган клетка дубалынын химиясы

Кислота-спирттин айырмалоочу таасиринин себеби микобактериянын кабыгында жатат. Анын түзүмдүк өзөгүн миколил-арабиногалактан-пептидогликан комплекси түзөт: пептидогликан арабиногалактанга байланышкан, ал эми арабиногалактандын сырткы учтарына өтө узун чынжырлуу микол кислоталары бекитилген. Алар липиддерге бай, өткөрүмдүүлүгү өзгөчө төмөн болгон сырткы микомембрананы түзөт. Микобактериялардын сырткы мембранасы тууралуу серепте бул түзүлүш кеңири баяндалат. Тосмо эки багытта тең иштейт. Ал боёктун киришине каршылык көрсөтөт, ошондуктан киргизүү үчүн ысытуу же күчөтүлгөн негизги боёк керек. Ошондой эле ал боёктун чыгарылышына каршылык көрсөтөт, ошондуктан карбол-фуксин ичине киргенден кийин кислота-спирт аны кетире албайт. Кадимки бактерияларда мындай кабык жок болгондуктан, алар боёкту жоготот. Демек, кислотага туруктуулукту фуксиндин микол кислотасына химиялык байланышы катары эмес, липиддик тосмонун таасири катары түшүнүү туурараак.

Ушул химиялык өзгөчөлүк дагы бир көп кездешкен көрүнүштү түшүндүрөт: микобактериялар Грам ыкмасы менен начар жана туруксуз боёлот, кээде күңүрт мончок сымал формалар же боёлбогон «көлөкөлөр» катары көрүнөт. Алардын гидрофобдуу дубалы кристаллдык кызгылт көктүн киришин чектейт. Кислотага туруктуулукту аныктоочу боёо — Грам ыкмасынын өзгөртүлгөн түрү эмес. Ал клетка дубалынын башка касиетине негизделген өзүнчө айырмалоочу принцип. Башка эки ыкманын айырмасы жөнөкөй боёо менен Грам ыкмасын салыштырууда көрсөтүлгөн.

Үч ыкма, үч суроо

Бактерияларды бир боёк менен боёо ыкмаларынын кеңири тобу тууралуу микроскопиялык боёо атласынан караңыз.

Көк фондогу кызыл түс эмнени далилдей албайт

Кызыл таякчалар организмдер кислота-спирттин таасиринен кийин да карбол-фуксинди кармап калганын билдирет. Бул табылга Mycobacterium tuberculosis үчүн мүнөздүү болушу мүмкүн, бирок CDCнин кургак учукту аныктоо боюнча көрсөтмөсүндө башка микобактериялар да кислотага туруктуу экени так белгиленет. Ошондуктан түрдү аныктоо үчүн түскө карап чечим чыгаруу эмес, культуралык изилдөө жана нуклеин кислоталарын текшерүү керек.

Аткаруудагы каталар негизинен эки жуу баскычында топтолот. Жетишсиз түссүздөндүрүү фондук материалды кызыл бойдон калтырып, жалган оң жыйынтыкка алып келиши мүмкүн. Ашыкча түссүздөндүрүү начар кармалып турган негизги боёкту кетирип, жалган терс жыйынтыкка өбөлгө түзөт. Контрасттык боёк өтө коюу берилсе, аз сандагы бациллалар көк фондо көмүлүп калат. Калың сүртүндүлөр, чөкмө түзгөн реагенттер жана булганган жуу суусу да өз артефакттарын кошот.

Аткаруу канчалык так болбосун, сезгичтик микроорганизмдердин саны менен чектелет. Кадимки сүртүндү микроскопиясына какырыктын ар бир миллилитринде болжол менен 5,000ден 10,000ге чейин бацилла керек. CDCнин мурдагы далилдерди талдаган серептеринде культуралык изилдөө менен ырасталган өпкө кургак учугу учурларында сүртүндүнүн сезгичтиги болжол менен 45тен 80 пайызга чейин экени көрсөтүлгөн. Ошондуктан терс сүртүндү эч качан кургак учукту жокко чыгарбайт. CDCнин учурдагы көрсөтмөсү ар бир сүртүндү менен катар культуралык изилдөө жүргүзүүнү сактайт. Ошондой эле өпкө кургак учугу каралып жатканда жана жыйынтык бейтапты жүргүзүү тактикасын өзгөртө турган болсо, дем алуу жолдорунан алынган кеминде бир үлгүдө нуклеин кислоталарын амплификациялоо тестин жүргүзүүнү сунуштайт.

Практикалык иш бекитилген протоколдорго ылайык жүргүзүлөт

Окутуу үчүн берилген түшүндүрмөлөр, анын ичинде бул макала, клиникалык иш жүргүзүүгө уруксат бербейт. Лабораториялык практикада CDC, APHL же CLSIнин учурдагы документтерине ылайыкташтырылган, лабораторияда валидацияланган стандарттык иштөө жол-жобосун аткарыңыз. CDCнин Stacks архивиндеги кислотага туруктуулукту аныктоочу боёо боюнча маалымдама мындай жол-жоболордо реагенттер жана жыйынтыкты баалоо кандай так көрсөтүлөрүн түшүндүрөт. Кургак учукка байланыштуу үлгүлөр менен иштөөдө биологиялык коркунучту чектөө зарыл: сүртүндүлөр биологиялык коопсуздук шкафында даярдалат, анткени даярдоо учурунда аэрозолдор жана чачырандылар пайда болот. CDCнин лабораториялык коопсуздук көрсөтмөсүндө ысытуу менен бекитилген сүртүндүлөрдө да тирүү кургак учук бациллалары болушу мүмкүн экени жана алар менен дагы эле булганган материал катары иштөө керектиги айтылат. CDCнин Коомдук саламаттык сактоо сүрөттөр китепканасындагы M. leprae үчүн текшерилген, карбол-фуксин жана метилен көгү менен боёлгон сүртүндү тууралуу жазуу бул ыкма кургак учук менен гана чектелбесин эске салат: кислотага туруктуу организмдер изделген бардык жерде ошол эле көк фондогу кызыл контраст колдонулат. Ал эми кылдат текшерүүдөн алынган терс жыйынтык да өзүнчө каттоого татыктуу натыйжа.

Даяр препаратты кароо

Контрасттык боёктун пайдалуулугу алгачкы кароодо көрүнөт. Микроскопист аз чоңойтууда карап жатканда адегенде көк фон аркылуу сүртүндүнүн сапатын баалайт: клеткалар бир калыпта жайгашканбы, фокустоо үчүн организмдин бүтүн клеткалары барбы, көп чөкмө жокпу. Андан кийин кызыл түстөгү шектүү объектилер көзгө урунат, анткени айнектеги башка эч нерсе кызыл эмес. Ырастоо майлуу иммерсияда жүргүзүлөт. Анда чыныгы бациллалар бир өңчөй боёк калдыктары эмес, күтүлгөндөй ичке, кээде бир аз ийилген же мончок сымал таякчалар болуп көрүнөт.

Фондун боёлушу корутундуда колдонулуучу сөздөрдү да аныктайт. Кызыл бациллалары бар препарат боюнча кислотага туруктуу бациллалар байкалганы билдирилет; көп учурда лабораториянын шкаласына ылайык жарым сандык баа да берилет. Кызыл организмдери жок препарат боюнча кислотага туруктуу бациллалар байкалбаганы жазылат, эч качан кургак учукка терс деп айтылбайт. Бул айырма маанилүү: көк фон боёо иштегенин, клеткалар контрасттык боёкту сиңиргенин жана оптикалык шарттар жетиштүү болгонун тастыктайт, бирок аныктоо чегинен төмөн сандагы организмдер тууралуу эч нерсе айтпайт. Кызыл таякчаларсыз көк фон — препарат жөнүндө жарактуу жыйынтык, бейтап жөнүндө акыркы өкүм эмес.

Милдеттердин бөлүштүрүлүшүн эстесеңиз, корутунду жазуу жеңил болот. Карбол-фуксин шектүү организмдерди көрсөтөт. Кислота-спирт сыноону аткарат. Метилен көгү жоопту гана окула тургандай кылат: кызыл түс боёк кислотанын таасирине карабай сакталып калганын, көк түс анын кетирилгенин билдирет. Калган маалыматтын баары — түрү, организмдердин саны жана клиникалык мааниси — предметтик айнектен тышкары жүргүзүлгөн иштерден алынат.