Метилен көгү жана азот оксиди: NOS, cGMP жана кан тамырлардагы сигнал берүү

Суроо жөнөкөй угулат: метилен көгү азот оксидинин сигналын басаңдатабы? Лабораторияда бул суроо төрт өзүнчө суроого бөлүнөт жана ар бири башка эксперименттик текшерүүнү талап кылат. Аларды чаташтыруу — метилен көгү менен азот оксиди жөнүндө жазылгандар ишенимдүү көрүнгөнү менен, бүдөмүк болуп калышынын негизги себеби.

Азот оксидинин сигналын төрт звенодон турган чынжыр катары элестетиңиз. Азот оксидинин синтазасын түзүү үчүн ген транскрипцияланат. Фермент аргининди азот оксидине айлантат. Газ башка бир зат менен реакцияга киргенге чейин диффузия аркылуу бутага жетет. Эригич гуанилатциклаза аны аныктап, циклдик GMP түзөт. Метилен көгүнүн ар бир звеного таасири жөнүндө жарыяланган маалыматтар бар, бирок далилдер ар башка эксперименттик системалардан, ар башка концентрациялардан жана ар башка изоформалардан алынган. Бир звенодогу натыйжа башка звеного таасир бар экенин далилдебейт.

Негизги чынжырдын жөнөкөй түшүндүрмөсү

Кан тамырдын дубалында кадимки ырааттуулук мындай жүрөт. Стимул эндотелий клеткасына таасир этет. eNOS же NOS3 деп аталган эндотелийдин азот оксиди синтазасы азот оксидинин чакан импульсун түзөт. Газ диффузия аркылуу коңшу жылма булчуң клеткасына өтүп, эригич гуанилатциклазаны түзгөн гемдин калыбына келтирилген темирине байланышат жана GTPнин циклдик GMPге айланышын тездетет. Циклдик GMP протеинкиназа Gни активдештирет, кальцийди жөнгө салуу өзгөрөт жана булчуң бошоңдойт.

Өзүнчө кароо керек болгон экинчи чынжыр да бар. Инфекция учурунда же цитокиндердин таасиринде клеткалар башка ферменттин — индукциялануучу азот оксиди синтазасынын, башкача айтканда iNOS же NOS2нин — генин транскрипциялайт. Ал eNOSко караганда азот оксидинин көбүрөөк жана узагыраак созулган агымдарын түзөт. Үчүнчү изоформа — нейрондук NOS, же nNOS — дагы башка контекстке таандык. Макалада изоформасы көрсөтүлбөстөн азот оксиди синтазасы деп айтылса, токтоп, кайсынысы өлчөнгөнүн текшериңиз. Метилен көгүнүн электрондорду кантип өткөрөрү тууралуу серепте да кычкылдануу-калыбына келүү буталарына карата ушундай эле ой айтылат: электрон өткөрүүчү ортомчу өз алдынча эч нерсе жасабайт, ал эми ар бир учтагы өнөктөш натыйжаны аныктайт.

Өлчөнгөн циклдик GMP да ферменттин түздөн-түз анализи эмес, бир нече процессти бириктирген көрсөткүч. Анын деңгээли циклаза аркылуу синтезделген көлөм менен фосфодиэстеразалар, айрыкча кан тамырдын жылма булчуңундагы PDE5, аркылуу ажыраган көлөмдүн айырмасын чагылдырат. Демек, циклдик GMPнин азайышы сигналды кабыл алуучуга азыраак сигнал жеткенин билдирет. Бирок мунун өзү кайсы звено иштен чыкканын көрсөтпөйт.

1-звено: iNOS ферменти азыраак түзүлөт

Бактериялык липополисахарид, интерферон-гамма же экөө тең стимулдаган чычкандын макрофагдарында метилен көгү iNOS белогунун күтүлгөн көбөйүшүнө жол бербей, iNOSтун маалыматтык РНКсын кескин азайткан. Бул макрофагдардагы транскрипция эксперименттеринде көрсөтүлгөн. Мында эмне өзгөрбөгөнү өзгөчө маанилүү. I каппа B альфа ингибиторунун ажырашы, NF каппа B менен STAT1дин фосфорлонушу жана бул факторлордун ядрого өтүшү негизинен сакталган. Азайган нерсе — алардын ДНКга байланышы. Муну хроматиндин иммунопреципитациясы тастыктап, iNOS промоторуна бул факторлордун байланышы азайганын көрсөткөн.

Бул — бар ферментти дароо бөгөттөө эмес, ферменттин көлөмү аныкталганга чейинки генди жөнгө салуучу таасир. Ал сезгенүү сигналдарына тиешелүү: белок пайда болушу үчүн транскрипция факторлору адегенде промоторго байланышы керек. Бул натыйжа тынч абалдагы кан тамырдагы конститутивдүү eNOS жөнүндө түздөн-түз эч нерсе айтпайт, ошондуктан аны дал ушул чекте сүрөттөө керек.

2-звено: бар NOS ферменти жайыраак иштейт

Келемиштерге жүргүзүлгөн изилдөө башка деңгээлди текшерген. Эс-учун жоготпогон эркек келемиштерге липополисахарид вена аркылуу берилген. Үч сааттан кийин аларга вена аркылуу туздуу эритме же 3 mg per kg өлчөмүндө метилен көгү берилген. Андан соң гипоталамустун медиалдык базалдык бөлүгүндөгү азот оксиди синтазасынын активдүүлүгү белгиленген аргининдин цитруллинге айланышы боюнча өлчөнгөн. Бул гипоталамустагы NOS активдүүлүгүн изилдөөдө баяндалган. Стресс жана туздуу эритме өздөрү эле кальцийден көз каранды эмес белгилүү бир активдүүлүктү пайда кылган, ал эми липополисахарид аны көзөмөл деңгээлинен болжол менен он эсе жогорулаткан. Метилен көгү индукцияланган эки компонентти тең жойгон. Ошол кыртышта, ошол дозада жана ошол убакытта кальцийге көз каранды конститутивдүү активдүүлүк өзгөргөн эмес.

Бул натыйжаны кандай жазылса, так ошондой түшүнүү керек: ошол шарттарда өлчөнгөн iNOS тибиндеги активдүүлүк басаңдаган. Бул ген экспрессиясынын өлчөөсү эмес жана метилен көгү дайыма eNOS же nNOSко караганда iNOSко тандалма таасир этерин далилдебейт. Тазаланган ферменттер менен жүргүзүлгөн иштер мындан да этият болууну талап кылат. Тазаланган азот оксиди синтазасынын түз анализдеринде метилен көгү 30 micromolar концентрацияда цитруллиндин түзүлүшүн толук бөгөттөгөн. Жарым-жартылай басаңдатуучу концентрация супероксиддисмутаза жокто болжол менен 5.3 micromolar, ал эми ал барда 9.2 micromolar болгон. Бул тазаланган NOS менен гуанилатциклазаны салыштырууда билдирилген. Тазаланган nNOS боюнча өзүнчө изилдөө ферментке байланышкан гемдин кычкылданышын механизм катары көрсөткөн. Практикалык тыянак мындай: бөлүнүп алынган системаларда NOSтун түздөн-түз басаңдашы чындап болот, бирок гипоталамустагы натыйжаны метилен көгү бардык жерде бардык конститутивдүү NOSко таасир этпейт деген жалпы билдирүүгө айландырууга болбойт.

3-звено: азот оксиди жеткенге чейин жоголот

Циклдик GMPнин азайышын ферментти бөгөттөөдөн башка механизм да түшүндүрө аларын эң айкын көрсөткөн эксперимент өстүрүлгөн коёндун өпкө артериясынын жылма булчуң клеткаларында жүргүзүлгөн. Экспериментте азот оксидинин донорлору түздөн-түз кошулуп, эндогендик NOS толугу менен айланып өтүлгөн. Андан кийин метилен көгү циклдик GMP жообун ошондо да басаңдатабы деген суроо текшерилген. Бул кан тамырдын жылма булчуңундагы супероксидди изилдөөдө баяндалган.

Үч донор 1ден 100 micromolar чейинки концентрацияларда текшерилген: S-нитрозо-L-цистеин, натрий нитропруссиди жана MPANO деп аталган туруктуу дезаминделген аналог. Алардын баары циклдик GMPни болжол менен 1.5 эседен 12 эсеге чейин көбөйткөн. 10 micromolar концентрациядагы метилен көгү биринчи экөөнүн жообун 51ден 100 пайызга чейин басаңдаткан, ал эми MPANOго болгон жоопту өзгөрткөн эмес. Эгер метилен көгү циклазаны жөн гана каталитикалык борборунан бөгөттөсө, донорлорго карата мындай тандалмалуулукту түшүндүрүү кыйын болмок, анткени үчөө тең кийинки бир эле ферментке таасир этет.

Андан кийинки үч көзөмөл текшерүүсү механизмди супероксид менен байланыштырган. Биринчиден, ксантин менен ксантиноксидазанын жардамы аркылуу клетка сыртында супероксид түзүү ошол эле көрүнүштү кайталаган: CYSNO менен нитропруссиддин жообу бөгөттөлүп, MPANOнун жообу сакталган. Экинчиден, метилен көгү жылма булчуң клеткаларында дозага жана убакытка көз каранды супероксид өндүрүшүн пайда кылган; бул цитохром cнин калыбына келиши аркылуу өлчөнгөн. Үчүнчүдөн, супероксиддисмутаза басаңдатууну толук алдын алган, ал эми каталаза андай кылган эмес. Демек, бул эксперименттик системада түздөн-түз катышкан бөлүкчө суутек пероксиди эмес, супероксид болгон.

Эксперименттин клеткаларды чогуу өстүрүү вариантына да токтолуу керек, анткени ал таасирдин мейкиндиктеги ордун аныктайт. Жабуучу айнекчелердеги эндотелий клеткалары жылма булчуң клеткалары менен кыска убакытка чогуу өстүрүлгөн. Ошондо базалдык түрдө бөлүнгөн эндотелий фактору жылма булчуңдагы циклдик GMPни үчтөн сегиз эсеге чейин көбөйткөн. Эки бөлүктүн кайсынысын болбосун алдын ала метилен көгү менен иштетүү бул сигналды азайткан, ал эми супероксиддисмутаза эндотелийди алдын ала иштетүүнүн таасирин жарым-жартылай жойгон. Башкача айтканда, метилен көгү жылма булчуңдагы сигналды кабыл алуучу клетканын ичинде сөзсүз иштеши керек эмес. Ал кабарчы молекуланы жолдо жок кылып, сигналды азайта алат. Метилен көгү боюнча изилдөөлөрдү окуу колдонмосу муну жалпы эреже катары карайт: молекулалык бутаны атоодон мурда кийлигишүү болгон бөлүктү атаңыз.

Муну NOSтун басаңдашы деп атоо туура эмес болмок. Донорлор иштеши үчүн синтаза баскычы талап кылынган эмес, бирок сигнал баары бир азайган.

4-звено: сигналды кабыл алуучунун өзү начарыраак жооп берет

Эригич гуанилатциклазага түз таасирлер бар, бирок концентрациялар маанилүү. Жогоруда келтирилген тазаланган ферменттерди салыштырууда азот оксиди стимулдаган циклазаны жарым-жартылай басаңдатуу үчүн болжол менен 60 micromolar метилен көгү талап кылынган. Ал эми NOSту жарым-жартылай басаңдатуучу концентрация болжол менен 5тен 9 micromolar чейин болгон. Атүгүл 1 millimolar концентрация да максималдуу бөгөттөөнүн жарым-жартылай деңгээлине гана жеткирген. Бул концентрациялардын ортосунда болжол менен алтыдан он бир эсеге чейинки айырма бар. Демек, аз микромолярдык концентрациядагы клеткалык экспериментте циклдик GMP азайса, циклдик GMPнин санына гана таянып муну циклазаны тандалма басаңдатуу деп атоого болбойт.

Кийинчерээк жүргүзүлгөн кычкылдануу-калыбына келүү изилдөөсү дагы бир эскертүү кошкон: метилен көгү азот оксиди активдештирген циклазаны гемдин темири абада жөн гана кычкылдангандагыдан башка механизм аркылуу активсиздендирген. Демек, сигналды кабыл алуучунун иши бузулушу мүмкүн, бирок бул процесстин химиясы толук аныктала элек. Концентрациялардын айырмасы аз микромолярдык таасирлерде алгач супероксиддин жана NOSтун таасирлерин жокко чыгаруу керектигин билдирет. Фосфодиэстеразаларды көзөмөлдөө да ушул жерге тиешелүү. Эгер ажыроо өлчөнбөсө же бөгөттөлбөсө, циклдик GMPнин азыраак топтолушу синтездин азайышына да, ажыроонун тездетилишине да, экөөнө тең да шайкеш келет.

Эмне үчүн мунун баарын кан басымы жөнүндө бир билдирүүгө сыйдырууга болбойт

Ар бир звено башка системада аныкталган. Макрофагдагы транскрипция гипоталамустагы ферменттик активдүүлүк эмес. Липополисахаридден кийинки гипоталамустун активдүүлүгү тынч абалдагы эндотелий тонусу эмес. Чогуу өстүрүлгөн клеткаларда базалдык түрдө бөлүнгөн эндотелий фактору агонист стимулдаган кан тамырдын кеңейиши эмес. 10 micromolar метилен көгү таасир эткен өстүрүлгөн өпкө артериясынын клеткалары адамдын кан айлануу системасы эмес. Булардын баарын «метилен көгү азот оксидин бөгөттөп, кан басымын көтөрөт» деген сыяктуу билдирүүгө бириктирүү көзөмөл текшерүүлөрү сактап калууга багытталган айырмачылыктардын өзүн жокко чыгарат.

Үч текшерүү түшүндүрмөнүн тактыгын сактайт. Биринчиден, изоформаны атаңыз: тынч абалдагы кан тамыр тонусу үчүн eNOS, индукцияланган сезгенүү агымы үчүн iNOS, нейрондорго жана айрым тазаланган ферменттерге байланыштуу контексттер үчүн nNOS. Экинчиден, азот оксидинин сигналы кантип жеткирилгенин атаңыз: эндогендик синтезби, эндотелийден базалдык бөлүнүп чыгышыбы же CYSNO, нитропруссид, MPANO сыяктуу белгилүү бир донорбу. Анткени туруктуу донор метилен көгүнүн таасирине туруштук берген, ал эми туруксуз донорлор андай болгон эмес. Үчүнчүдөн, концентрацияны жана жоопту калыбына келтирген көзөмөлдү атаңыз: супероксиддисмутаза менен жооптун калыбына келиши супероксиддин катышын көрсөтөт; каталазанын натыйжасыздыгы ошол системада суутек пероксидинин ролуна каршы далил болот; ксантиноксидазанын таасирди кайталоосу механизмдин жетиштүүлүгүн көрсөтөт; ал эми тазаланган ферменттердин анализдери катализге түз таасирлерди сигнал жолдо жоголгон учурлардан ажыратат.

Кыскача жыйынтык мындай. Метилен көгүн циклазаны тандалма бөгөттөөчү зат эмес, азот оксидинен циклдик GMPге чейинки сигнал берүүнү бир нече жерде өзгөрткөн зат катары кароо туурараак. Эксперименттик системага жана концентрацияга жараша ал iNOSтун транскрипция факторлорунун байланышуусун азайтып, NOS ферменттерин түздөн-түз басаңдатып, супероксид түзүү аркылуу азот оксидинин жеткиликтүүлүгүн төмөндөтүп жана азот оксиди активдештирген циклазаны начарлата алат. Кан тамыр изилдөөлөрүндө циклдик GMP аркылуу сигнал берүүнүн ролу жана клеткалык анализдерде колдонулган азот оксиди донорлорун салыштыруу бул бутактардын ар бирин кеңири карайт. Ал эми кычкылдануу-калыбына келүү таасирлерин ферменттик таасирлерден ажыратуу ыкмалары бул адабияттарда эмне үчүн супероксиддисмутаза, каталаза жана туруктуу донор менен көзөмөл ушунчалык көп колдонуларын түшүндүрөт.

Метилен көгүнөн кийин циклдик GMPнин төмөн болушу чынжырдын үзүлгөнүн көрсөтөт. Кайсы звено үзүлгөнүн көзөмөл текшерүүлөрү гана аныктайт.