Метилен көгү жана аутофагия: AMPK, mTOR жана нейрондордогу эксперименттер

Клеткалар менен эксперимент жүргүзүп, метилен көгүн кошконуңузду жана блотто LC3-II деп аталган белок тилкеси кочкулданганын көргөнүңүздү элестетиңиз. Кошулма «аутофагияны күчөтөт» деп жарыялап, андан ары улантуу азгырыгы жаралат. Бирок мындай чечмелөө эртелик кылат. LC3-II тилкесинин кочкулданышы клетка тазалоочу везикулаларды көбүрөөк түзүп жатканын да, жок кылуу этабы бөгөлгөндүктөн везикулалар топтолуп жатканын да билдириши мүмкүн. Бул эки чечмелөө карама-каршы багыттарды көрсөтөт, ал эми нейрондордогу метилен көгү тууралуу адабиятта далилдердин эки түрүнүн тең мисалдары бар. Бул макала ар бир анализ боюнча чындыгында эмне өлчөнгөнүн карап чыгат.

Бул жерде изилденген түрү — макроаутофагия — клетканын материалдарды жапырт кайра иштетүү механизми. Фагофор деп аталган мембраналык капча эскирген белокторду жана органеллаларды курчап өсөт, жабылып аутофагосомага айланат, лизосома менен биригет, андан соң анын жүгү ажыратылып, кайра колдонуу үчүн бошотулат. Нейрондор бул үзгүлтүксүз процесске көз каранды, анткени алар бөлүнбөйт жана бузулган бөлүктөрдүн үлүшүн бөлүнүү аркылуу азайта албайт. Кайра иштетүү токтосо, калдыктар топтолот. Ал иштеп турганда, клетка стресс учурунда курулуш материалдарын кайра алат.

Гиппокамптагы бир эксперимент эмнени көрсөттү

Индукция боюнча негизги изилдөөдө чычкандын гиппокампынан алынган HT22 клеткалары колдонулган. Алар 24 саат бою кан сары суусуз калтырылып, стресске дуушар болгон: бул шарт өсүү факторлорун жана трофикалык сигналдарды алып салып, апоптозду да, аутофагияны да козгойт. Изилдөөчүлөрдүн билдирүүсүнө ылайык, метилен көгү клеткалардын өлүшүн дозага жараша азайткан жана бул коргоо макроаутофагиянын белгилери менен коштолгон.

Маркерлердеги өзгөрүүлөр так болгон. LC3Bнин диффуздуу боёлушу метилен көгүнүн болжол менен 20 nM концентрациясынан баштап ядронун айланасындагы чекит сымал очокторго кайра бөлүштүрүлгөн; LC3-I жана LC3-IIнин эң күчтүү жообу 1 μM чамасында байкалган. LC3B-I да, LC3B-II да дозага жана убакытка жараша көбөйгөн. Эң маанилүүсү, топ статикалык LC3 блоту менен эле чектелген эмес. Алар лизосомалык тазаланууну бөгөттөгөн 10 μM хлорохинди кошуп, метилен көгү менен иштетилген клеткаларда LC3-IIнин жогорулашын жана p62нин туруктуу сакталышын аныкташкан. Бул көрүнүш жөн гана топтолууну эмес, лизосомага көз каранды жаңыланууну колдойт. Ошондой эле алар хлорохин апоптозго каршы таасирди жарым-жартылай кайтарганын көрсөтүшкөн; бул ушул моделдеги коргоону аутофагия жана лизосома жолу менен байланыштырат.

Сигналдашуу боюнча жыйынтык эң көп туура эмес келтирилет. Фосфорлонгон AMPK жана анын төмөнкү баскычтагы бута белогу — фосфорлонгон ACC аркылуу бааланган AMPK сигналдашуусу 12 жана 24 саатта дозага жараша жогорулаган. Акыркы 4 саатта 20 μM концентрацияда колдонулган AMPK ингибитору Compound C ACCнин фосфорлонушун да, LC3 активдешүүсүн да азайткан. Ал эми фосфорлонгон mTOR боюнча аныктоого мүмкүн болгон басаңдоо байкалган эмес. Демек, стресске дуушар болгон гиппокамп клеткаларында AMPK менен байланышкан индукция, сыягы, mTORдон көз карандысыз жол аркылуу жүргөн. Ушундай эле көрүнүш тирүү чычкандарда да байкалган: метилен көгү менен иштетүү мээнин кыртышында жана гиппокампта макроаутофагия маркерлеринин пайда болушун шарттаган.

Индукция толук аяктаган агым эмес

Бул жерде түшүнүктөрдүн айырмасы өзгөчө маанилүү. Индукция — баштапкы баскычтагы механизмдердин көбүрөөк аутофагосома түзүшү. Агым — жүктүн бүт жолду басып өтүшү: обочолонтуу, жетилүү, лизосома менен биригүү, ажыратуу жана кайра иштетүү. Агымды текшерүү калган жолдун өткөнүн ырастамайынча, LC3-IIнин ар бир көбөйүшү индукция жөнүндө гана тыянакка негиз болот.

Агымды текшерүүнүн стандарттуу ыкмасы LC3-IIни бафиломицин A1 же хлорохин сыяктуу каражат менен лизосомалык процессти кыска мөөнөткө бөгөттөгөндө жана бөгөттөбөгөндө өлчөйт. Эгер иштетүү чындап түзүлүүнү тездетсе, ажыроону бөгөттөө LC3-IIни андан да жогорулатышы керек. Тандемдик mCherry-GFP-LC3 репортёру дагы бир өңүттү кошот: түзүлүштөр лизосома менен бириккенге чейин сары түстө, ал эми кычкыл чөйрө GFP сигналын өчүргөндөн кийин кызыл түстө гана жаркырайт. Ошондуктан кызыл гана түстөгү чекит сымал очоктордун көбөйүшү кычкыл автолизосомаларга өтүүнү колдойт. p62 белогунун азайышы жүктүн жаңылануусун ырастай алат, бирок p62 транскрипциясы өзү да стресске жооп берерин эске алып, аны mRNA деңгээлинде текшерүү керек.

Төмөнкү текшерүү тизмеси бул адабиятта колдонулган ар бир анализ эмнени өлчөөрүн жана өз алдынча эмнени далилдей албасын көрсөтөт. Окурмандар аны макроаутофагия тууралуу келечектеги каалаган билдирүүнү, анын ичинде ушул маркерлерге таянган ачка жүрүү жана узак жашоо жөнүндөгү жүйөлөрдү баалоодо колдоно алышат.

Таблица сактанууга жардам берген бир сөз колдонуу катасына көңүл буруңуз. Фосфорлонгон ACC — ферменттик активдүүлүгү басаңдатылган форма. Анын көбөйүшү ACC активдешүүсүн эмес, AMPKнин сигналдык жыйынтыгын көрсөтөт.

«Макроаутофагияны бөгөттөө нейрокоргоону жокко чыгарды» деген сөз айкашы да ушундай тактыкты талап кылат. HT22 моделинде бул аутофагия жана лизосома жолуна кийлигишүү кан сары суусу жок шартта метилен көгү берген жашап калуу артыкчылыгын жойгонун билдирет. Бул ошол культурада аутофагия зарыл болгонун же салым кошконун колдойт. Бирок ал аутофагия кошулманын жалгыз коргоочу механизми экенин аныктабайт, хлорохин аутофагия аркылуу гана таасир этерин далилдебейт; себептик тыянакты бекемдөө үчүн ATG5, ATG7 же ULK1ге генетикалык кийлигишүү керек болмок.

Бир механизмге алып барган эки жол

Жөнөкөйлөтүлгөн схема түшүнүүгө жардам берет. Энергетикалык стресс AMPKни жогорулатат, AMPK ULK1 комплексин активдештирет жана аутофагия башталат. Өсүү факторлору менен азык заттар mTORC1ди жогорулатат, mTORC1 ULK1ди басаңдатат жана аутофагия ишке кирбейт. ULK1ден кийинки баскычтарда Beclin-1 жана VPS34 комплекси фагофордун түзүлүшүн баштайт, LC3-I липиддешип LC3-IIге айланат, аутофагосома жабылат, лизосома менен биригет жана жүк ажыратылып, p62 да жаңылануу процессинен өтөт.

Схема метилен көгү боюнча ар бир жыйынтыкты ушул картага жайгаштырат: гиппокамптагы жыйынтык AMPK бутагынын жанына, прогениторлордогу жыйынтык mTOR бутагынын жанына коюлган.

Мындай кароо Xieнин экинчи изилдөөсү менен болгон көрүнгөн карама-каршылыкты чечет. Көбөйүп жаткан келемиштин нейрондук прогенитор клеткаларында жүргүзүлгөн өзүнчө эксперимент 5 μM метилен көгү көбөйүүнү басаңдатып, тынч абалга өтүүгө түрткү бергенин аныктаган: Ki67-позитивдүү клеткалар 1 жана 3-күндөрдө азайган, ал эми нейрондук багыты аныкталган дифференциация бузулган эмес. Ал жерде механизм mTOR сигналдашуусунун басаңдашы аркылуу жүргөн: жалпы mTOR жана фосфорлонгон mTOR азайып, p70S6K менен 4EBP1 экспрессиясы төмөндөгөн, ошондой эле E1, B1, D1 жана D2 циклиндеринин жөнгө салынышы төмөндөгөн. Негизги фенотип прогениторлордун тынч абалы болгон; авторлор муну стресске кабылган гиппокамп клеткаларын сактап калууга эмес, клеткалык карылыктын кечеңдешине байланыштырган.

Бул эки макаланын ортосунда карама-каршылык жок. AMPK жана mTOR — туруктуу которгучтар эмес, шартка жараша иштеген интеграторлор. Стресске кабылган нейрон сымал клетка mTORдун өлчөнө турган басаңдоосусуз эле AMPKни ишке киргизиши мүмкүн, ал эми митоген түрткү берген прогенитор ошол эле кошулмага mTORго көз каранды өсүү механизмдерин жайлатуу менен жооп бериши мүмкүн. Клетканын түрү, стресстин шарты, концентрация жана өлчөө учуру кайсы бутак үстөмдүк кыларын аныктайт. Метилен көгүнүн митохондриялык энергияга жана кычкылдануу-калыбына келүү процесстерине тийгизген таасирлери да ушул эле жалпы көрүнүшкө кириши керектигинин себеби ушунда: нейрокоргоо механизмдери боюнча серепте баяндалгандай, кошулма альтернативдүү электрон ташуучу катары иштейт, антиоксиданттык жана апоптозго каршы сигналдашууну ишке киргизет, MAO жана NOSту басаңдатат жана биогенез менен аутофагия аркылуу митохондриялардын жаңылануусуна байланышат. Аутофагия — көп багыттуу таасирлердин бир бутагы гана, бүтүндөй көрүнүш эмес.

Эксперименттер эмнени көрсөтпөйт

Кан сары суусуз калтыруу клетка культурасында трофикалык жана зат алмашуу стрессин моделдейт. Ал бүт организмдин ачка жүрүшүн моделдебейт: глюкоза, аминокислоталар жана туздар негизги чөйрөдө кала берет, ал эми тамактануу жүрүм-туруму жок. Культурадагы 20 nMден 5 μMге чейинки концентрацияларды арифметика аркылуу адамдар үчүн дозаларга айландырууга болбойт, анткени сиңүү, белоктор менен байланышуу, кычкылдануу-калыбына келүү абалы, зат алмашуу, ткандарда топтолуу жана таасир этүү мөөнөтү айырмаланат.

Бейтаптарда метилен көгү шарттаган аутофагиялык агымды көрсөтүүгө багытталган адамдагы бир да сыноо иштелип чыккан эмес. Механизмдер боюнча далилдер клеткалык, ex vivo жана жаныбарлардагы иштердин деңгээлинде калууда, ал эми серептер клиникалык колдонууга өтүү боюнча далилдерди дагы эле алдын ала маалымат катары сүрөттөйт. Демек, бул изилдөөлөр метилен көгү ачка жүрүүнү кайталай турганын, аутофагия аркылуу адамдын өмүрүн узартарын же адамдын мээсинде аутофагиялык агымды толук аяктатарын көрсөтпөйт. Ачка жүрүүнү туураган таасирлер жана узак жашоо жөнүндөгү билдирүүлөр өзүнүн клиникалык далилдерин талап кылат; метилен көгүнүн адамдардагы башка көрсөткүчтөр боюнча сыноолору жөн гана байланыштырылганы үчүн аутофагия сыноолоруна айланбайт. Азык заттарга байланышкан стресс жана узак жашоо моделдери боюнча изилдөөлөрдү ушул чекти эске алуу менен окуу керек.

Кийинки макаланы окуганда текшерүү тизмесин ирети менен колдонуңуз. Алгач кайсы бутак өзгөргөнүн сураңыз: AMPKби, mTORбу же экөө тең өзгөргөн жокпу. Андан соң LC3 жыйынтыгы агымдын текшерүүсү менен коштолгонбу же өз алдынча берилгенби, тактаңыз. Андан кийин жолду бөгөттөө пайдалуу таасирди жойгонбу жана кайсы ыкма колдонулганын текшериңиз. Ушул үч суроонун баарына жооп берген изилдөө механизм боюнча күчтүү тыянакка негиз берет. Биринчисине гана жооп берген изилдөө уруксат берүүчү сигналды гана көрсөткөн болот, ал эми жолдун калган бөлүгү дагы эле картага түшүрүлө элек.