Жаңы метилен көгү жана ретикулоциттерди боёо: өзүнчө боёк жана тирүү клеткалар менен иштөө ыкмасы

Студент ретикулоциттерди эсептөөгө даярданып, метилен көгүн буюртма кылат, аны кан менен аралаштырат, бирок дээрлик эч нерсе көрбөйт. Курсташы «жаңы метилен көгү» деп белгиленген бөтөлкөдөгү боёкту колдонуп, кызыл кан клеткаларынын бир бөлүгүндө даана көк жипчелерди көрөт. Биринчи студент экинчи бөтөлкөдөгү боёк жаңыраак же концентрациясы жогору деп ойлойт. Бирок экөө тең туура эмес. Анын курамында башка молекула бар.

Бул жааттагы түшүнбөстүктөрдүн көбүнүн артында дал ушул түшүнүк катасы турат. Аталышы жаңы метилен көгүн метилен көгүнүн жакшыртылган партиясы сыяктуу көрсөтөт. Бирок химиясы башкача экенин далилдейт. Жаңы метилен көгү N — өзүнүн Colour Index номери, орун басуучу топторунун өзүнчө жайгашуу тартиби жана гематологиядагы стандартташтырылган милдети бар өзүнчө фенотиазин боёгу. Бул айырма түшүнүктүү болгондо, ыкманын калган бөлүгү да оңой түшүнүлөт: боёо учурунда клеткалар эмне үчүн тирүү болушу керек, кайсы клетка ретикулоцит болуп эсептелет, Гейнц денечелеринин орду кандай жана бриллиант крезил көгү качан колдонулат.

Кыскача жооп

Гематологиялык реагент болгон жаңы метилен көгү N адатта PubChem базасындагы жаңы метилен көгүнүн жазуусунда Basic Blue 24, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, C18H22ClN3S формуласы менен көрсөтүлөт. Кадимки метилен көгү PubChem базасындагы өз жазуусунда метилтиониний хлориди, Basic Blue 9, C.I. 52015, CAS 61-73-4, C16H18ClN3S формуласы менен көрсөтүлгөн. Түзүлүшү боюнча жаңы метилен көгүнүн шакекчесинде эки метил тобу жана этиламино каптал чынжырлары бар, ал эми метилен көгүндө диметиламино топтору бар. Бул айырма боёо касиеттерин өзгөртөт. Гематология боюнча окуу китептеринде кадимки метилен көгү ретикулоциттерди салыштырмалуу начар боёочу, ал эми жаңы метилен көгү каныгыраак жана бир калыпта боёочу каражат катары сүрөттөлөт. Бул салыштыруу ScienceDirect сайтындагы жаңы метилен көгү тууралуу темада жалпыланган.

Ооба, жаңы метилен көгү — суправиталдык боёк. Суправиталдык боёо организмден алынган тирүү клеткаларды фиксациялоого чейин боёону билдирет; бул аныктама NCBI сайтындагы суправиталдык боёонун принциптери тууралуу серепте берилген. Жаңы метилен көгү да, бриллиант крезил көгү да ушул категорияга кирет, ал эми CLSI ретикулоцит стандарты жаңы метилен көгүн түздөн-түз суправиталдык боёк катары камтыйт. Студенттер кээде муну фиксацияланган сүртүндүлөрдү Романовский ыкмасы менен боёого кошуп түшүнүшөт. Бул жерде андай түшүнүк жарабайт. Адегенде фиксация кылынса, ыкма иштебей калат.

Окшош боёк аталыштарына кызыккан окурмандар үчүн метил көгү менен метилен көгүнүн айырмасы аниондук триарилметан боёгу менен катиондук фенотиазиндер тобунун ортосундагы башка, кыйла кеңири чаташууну түшүндүрөт. Лабораториялык боёо ыкмаларынын сереби суправиталдык иштерди фиксацияланган сүртүндүлөр менен иштөө ыкмаларынын катарында карайт, ал эми кан клеткаларынын морфологиясы боюнча колдонмо ретикулоциттерди баалоонун кеңири лейкоцитардык дифференциалдык эсептөөдөгү ордун көрсөтөт.

Каталогдорго байланыштуу бир эскертүү: жаңы метилен көгүнүн цинк хлориди менен кош туз түрүндөгү өзүнчө формасы бар, анын номери CAS 6586-05-6. Ошондуктан ыкмалар бөлүмүндө жалпы аталышын гана эмес, туз формасын жана жеткирүүчүнү да көрсөтүү керек.

Суправиталдык боёо чындыгында эмне кылат

Ретикулоцит — ядросун жоготкон, бирок рибосомалык РНКнын калдыктарын сактап калган жаш кызыл кан клеткасы. Боёлбогон нымдуу препаратта бул РНК көрүнбөйт. Суправиталдык боёк тирүү клеткага кирип, ошол РНКны чөктүрөт же топтоштурат. Натыйжада май иммерсиясында көрүнгөн торчо-жипчелүү материалды түзгөн көк гранулалар жана жипчелер пайда болот. Демек, бул торчо — боёону күтүп турган даяр каркас эмес, боёонун натыйжасы. Ошондуктан протоколдун өзгөрмөлөрү — боёктун концентрациясы, буфер, кан менен боёктун катышы, температура жана убакыт — боёктун аталышындай эле маанилүү.

Мунун практикалык натыйжасы — аракеттердин катуу ырааттуулугу: адегенде антикоагулянт кошулган канды боёк менен аралаштыруу, инкубациялоо, андан кийин сүртүндүлөрдү даярдап, аларды фиксациясыз жана кошумча боёосуз кароо. Боёого чейин фиксациялоо же билинер-билинбес жипчелерди жаап калган кошумча боёо эсептөө үчүн зарыл маалыматты жок кылат.

Жаңы метилен көгү менен ретикулоциттерди боёонун жумушчу протоколу

Бирдиктүү универсалдуу курам жок, ошондуктан колдонулган курамды көрсөтүңүз. Документтештирилген үч вариант алардын айырмачылыктарын көрсөтөт.

Классикалык Брешер тибиндеги процедурада калий оксалаты кошулган болжол менен 0.5 пайыздык жаңы метилен көгү колдонулат. Ал жакшылап аралаштырылган EDTA кошулган кан менен бирдей көлөмдө аралаштырылып, бөлмө температурасында болжол менен 10дон 15 мүнөткө чейин инкубацияланат. Акырын кайра аралаштыргандан кийин жука, сына сымал сүртүндүлөр даярдалып, абада кургатылат жана фиксацияланбастан 100x май иммерсиялуу объектив менен каралат. NCBI сайтындагы ретикулоциттерди эсептөө процедурасында бул иш тартиби жана аны менен колдонулган эсептөө алкагы сүрөттөлгөн.

Дейси жана Льюис вариантында цитраттуу туз эритмесиндеги 1.0 пайыздык жаңы метилен көгү колдонулат. Ал кандын 2ден 4 көлөмүнө чейин аралаштырылып, сүртүндү даярдалганга чейин 37 C температурада 15тен 20 мүнөткө чейин кармалат. CLSI H44 процедурасын шайкештештирүүнүн жакында колдонулган вариантында pH 7.4 болгон фосфаттык буферленген туз эритмесиндеги кыйла суюк 0.1 пайыздык эритме колдонулуп, 20 C температурада 10 мүнөт инкубацияланган жана фиксация жүргүзүлгөн эмес. Бул 2026-жылдагы NMB шайкештештирүү изилдөөсүндө баяндалган.

Эсептөө эрежелери бардык варианттар үчүн бирдей. Клеткада көк түскө боёлгон кеминде эки өзүнчө гранула же жипче сегменти болсо, аны ретикулоцит деп эсептеңиз. Бул жалгыз боёк чөкмөсүн эсепке алуудан сактайт. Күнүмдүк иште кеминде 1,000 кызыл кан клеткасын эсептеп, ретикулоциттердин үлүшүн пайыз менен көрсөтүңүз. Үлүшү аз болгондо статистикалык талаптар көбүрөөк клетканы эсептөөнү талап кылат. CLSI H44 методологиясынын серебинде ретикулоциттер болжол менен 1 пайыз болгондо эсептөөнүн өзгөрмөлүүлүгүн 5 пайызга чейин түшүрүү үчүн болжол менен 4,400 клетка керек экени белгиленген; бул De Gruyter сайтындагы CLSI H44 серебинде келтирилген. Миллердин окулярдык диски көп сандагы клеткаларды эсептөөнү жеңилдетет. Боёкту чыпкалаңыз же жаңыдан даярдаңыз, анткени чөкмө гранулалуу кошулмаларга окшошуп көрүнөт.

Ошол эле препараттагы Гейнц денечелери

Ошол эле суправиталдык сүртүндүдө Гейнц денечелерин да көрүүгө болот. Алар РНК калдыктары эмес, кычкылданган жана денатурацияланган гемоглобиндин топтолмолору. Жаңы метилен көгү менен даярдалган препараттарда алар тегерек денечелер катары көрүнөт: көбүнчө жалгыз жана мембранага жакын жайгашып, торчо-жипчелүү материалга караганда ачыгыраак көк түскө боёлот. Фиксация жана кошумча боёо учурунда алар начар сакталат, ошондуктан фиксацияланбаган сүртүндүнү караңыз. Жакындагы бир протоколдо EDTA кошулган кандын 20 микролитри 1 пайыздык жаңы метилен көгүнүн 20 микролитри менен аралаштырылып, 15 мүнөт инкубацияланган. Андан соң 250 эритроциттин ичинен Гейнц денечелери бар клеткалардын саны аныкталган. Бул ошол процедураны баяндаган PMC изилдөөсүндө берилген.

Эки айырмачылык туура эмес чечмелөөнүн алдын алат. Биринчиден, метил кызгылт көгүшү жана кристалл кызгылт көгүшү Гейнц денечелерин жаңы метилен көгүнө караганда каныгыраак боёйт. Бул ScienceDirect сайтындагы Гейнц денечелери тууралуу темада белгиленген. Жаңы метилен көгү ретикулоциттер менен Гейнц денечелерин чогуу баалоодо ыңгайлуу, бирок Гейнц денечелерине арналган эң күчтүү боёк эмес. Экинчиден, альфа-талассемия белгиси бар учурда HbH кошулмалары суправиталдык боёодон кийин клетканын бүт аймагында көп сандагы майда чекиттерди пайда кылат. Ал эми классикалык Гейнц денечелери азыраак, чоңураак жана көбүнчө мембрана менен байланышкан болот. Үчүнчү окшош көрүнүш — боёк чөкмөсү: ал клеткалардын фокустук тегиздигинен тышкары жайгашат жана көрүү талааларынын ортосунда өзгөрүп турат.

Бриллиант крезил көгү менен жаңы метилен көгүнүн айырмасы

Эки боёк тең ретикулоциттер үчүн суправиталдык боёк болуп саналат, бирок стандартташтыруу алардын бирине артыкчылык берет. Гематологияны стандартташтыруу боюнча эл аралык кеңеш менен биргеликте иштелип чыккан жана CLSI H44 стандартынын барагында көрсөтүлгөн CLSI H44-A2 ретикулоцит ыкмасы EDTA кошулган канды жаңы метилен көгү менен боёону кол менен аткарылуучу салыштыруу ыкмасы катары белгилейт. Классикалык гематология окуусу да көрүнүш жагынан ушуга шайкеш келет: жаңы метилен көгү жипчелерди каныгыраак жана бир калыпта боёйт, ал эми бриллиант крезил көгүнүн натыйжасы партиялар менен үлгүлөрдүн ортосунда көбүрөөк өзгөрөт.

Бул макамга тактоо керек. ICSH анализаторлорду баалоо боюнча колдонмосу жаңы метилен көгү менен кол менен жүргүзүлгөн микроскопияны эталондук салыштыруу ыкмасы катары кабыл алат, бирок аны субъективдүү жана салыштырмалуу тактыгы төмөн деп мүнөздөйт. Мүмкүнчүлүк бар жерде агымдык цитометриянын эталондук процедураларына артыкчылык берилет. 2022-жылы 100 үлгү салыштырылган изилдөөдө колдонулган анализатордун жыйынтыгына карата системалуу четтөө жаңы метилен көгүнө караганда бриллиант крезил көгүндө төмөн болгон. Бул PMC сайтындагы боёо ыкмаларын салыштырган изилдөөдө баяндалган. Студенттер үчүн негиздүү жыйынтык мындай: жаңы метилен көгүн стандартташтырылган кол менен салыштыруу ыкмасы катары колдонуңуз, жергиликтүү бриллиант крезил көгү ыкмасын ага же автоматташтырылган ыкмага салыштырып текшериңиз жана кайсы боёк колдонулбасын, кол менен микроскопияда натыйжалардын чачыроосу кеңирээк болорун эске алыңыз. Мурдагы стандартташтыруу адабияттарында коммерциялык боёктордун партиялары айырмалангандыктан, тазаланган Azure B химиялык жактан тазараак альтернатива катары да сунушталган. Бул Маршаллдын Azure B боюнча изилдөөсүндө көрсөтүлгөн жана ыкмаларды талкуулоодо реагенттин тазалык даражасы эмне үчүн дагы эле айтыларын түшүндүрөт.

Кадимки каталардан сактануу

Ийгиликсиз препараттардын көбүнө төрт ката себеп болот. Жаңы метилен көгү N ордуна кадимки метилен көгүн буюртма кылуу техникалык себептен эмес, химиялык айырмадан улам начар боёого алып келет. Натыйжаны караганга чейин фиксациялоо же кошумча боёо суправиталдык сигналды жок кылат. Боёк чөкмөсүн гранула катары эсептөө натыйжаны ашырат; эки гранула эрежеси жана чыпкаланган боёк мунун алдын алат. Ретикулоциттердин үлүшү аз болгондо өтө аз клетка эсептөө так көрүнгөн, бирок ишеним чектери кең санды берет. Ар бир катанын белгиси бирдей: микроскопист реагент менен иштөө баскычында эле аныкталган натыйжа үчүн микроскопту күнөөлөйт.