Şîna metîlenê ji bo rengkirina DNA û RNA: bikaranîn di jel û membranan de

Xwendekarek elektroforeza jeleke agarozê dike, wê bi şîna metîlenê reng dike, û li cihê ku bendeke zelal li bendê bû tiştek nabîne. Li beşa teniştê, lêkolînerek piştî doktorayê membraneke Northern bi heman şûşeya şîn reng dike û di sê deqeyan de bendên rîbozomî yên zelal dibîne. Xwendekar encam digire ku jel têk çûye. Jel têk neçûye. Her du kar ji hev cuda bûn, û heman reng bi hestiyariya cuda, paşzemîna cuda û rêzikên cuda yên gavên paşîn bersiva wan dide.

Rengkirina DNA û rengkirina RNA bi şîna metîlenê heman kîmyayê parve dikin, lê armanca wan ne yek e. Di jelê de, reng nîşan dide ka di hundirê matrîseke bi kun de çiqas asîda nukleîk heye. Li ser membranê, nîşan dide ka veguhestin serketî bûye û ka hêman bi awayekî wekhev li rêçikan hatine barkirin. Gava ev cudahî zelal bibe, protokol, sînorên tespîtkirinê û sînorên lihevhatinê jî eşkere dibin.

Bersiva kurt

Şîna metîlenê rengekî katyonî yê rûht e ku bi awayekî nekovalent û vegerbar bi asîdên nukleîk ve girê dibe; ev bi tevliheviya kişandina elektrostatîk ber bi fosfatê ve, ketina nav cotên bazan û girêdana bi şivika biçûk re pêk tê. Xala bingehîn ev vegerbarî ye. Bend dikarin di bin ronahiya xuya de bên rengkirin, bên belgekirin, paşê rengê wan bê rakirin an jî ji bo klonkirin, hîbrîdîzasyon an kontrolkirina ji nû ve bi probê bên paqijkirin.

Ji bo rengkirina DNA ya du-zincîrî di jela agarozê de bi şîna metîlenê, reçeteya standard a bilez 0.02 ji sed w/v (200 micrograms di her mL de) di avê de ye, bi nêzîkî 15 deqeyên rengkirinê û nêzîkî 15 deqeyên rakirina rengê bi avê; jel li ser qutiyeke ronahiya spî tê dîtin. Ji bo membranan, reçeteya klasîk a Northern blotê 0.02 heta 0.04 ji sed reng di asetata sodyûmê de, li nêzî pH 5.2, bi çend deqeyên rengkirinê piştî veguhestin û sabîtkirinê ye; paşê şûştina bi avê û rakirina tevahî ya rengê berî hîbrîdîzasyonê tê kirin. Hestiyarî sînordar e: di şertên baş de, dehan heta sedan nanogram di her benda jelê de, û rêberên muhefezekar 0.5 heta 1 microgram destnîşan dikin. Ev ji rengên bromîda etîdyûmê û SYBR bi çend pîleyên mezinahiyê bilindtir e. Li ser membranan sînorekî tespîtkirinê yê yek transkrîptê ku bikêr bê tune ye, ji ber ku reng bi taybetî RNA ya rîbozomî ya pir û tevahiya madeya barkirî nîşan dide. Di tu ji van reçeteyan de şaneyeke pêveka ku di firotana perakende de tê firotin bikar neynin. Rêbazên pejirandî rengê bi pileya analîtîk, tamponên diyarkirî û, dema RNA tê bikaranîn, xebata bê RNase bingeh digirin.

Girêdan çawa dixebite, û li ku dikare bixe xapandinê

Modela bikêr ji sê beşan pêk tê. Ya yekem, pergala xelekan a bi barê pozîtîf ber bi pişta fosfatê ya bi barê negatîf ve tê kişandin. Lêkolînên spektroskopîk dibînin ku di xwêya kêm de ev pêkhateya elektrostatîk serdest e, lê modelkirin û dînamîka molekulî ketina nav cotên bazan û girêdana bi şivika biçûk re wek awayên stabîl ên girêdanê ji bo DNA ya du-zincîrî diparêzin, wek ku di lêkolîneke spektroskopîk a girêdana şîna metîlenê bi DNA re de hatiye kurtkirin. Ya duyem, tercîheke ji bo GC heye: modelkirin gavên CpG û GpC tercîh dike û ceribandin di xebata li ser tercîhên ketina şîna metîlenê nav cotên bazan de girêdana tercîhî bi dupleksên dewlemend bi GC re radigihînin, lê dupleksên AT jî girê didin. Rengkirina rojane ne taybetî rêza nukleotîdan e. Ya sêyem, DNA û RNA ya yek-zincîrî bi taybetî bi rêya elektrostatîkê û lihevçîna bi bazên gihîştbar û herêmên dupleks re girê didin; ji ber vê yekê hêza rengkirinê li gorî dirêjahî, rêz û avahiya duyemîn diguhere.

Du encam ji vê derdikevin. Ji ber ku girêdan nekovalent e, reng bi şûştinê derdikeve. Bendên polyakrilamîdê zû dimirin, heya ku bi zanebûn bên sabîtkirin; guhertoyeke taybet a sabîtkirina mayînde jî tam ji ber ku rengkirina asayî demkî ye hatiye pêşxistin, wek ku Soto û Draper ji bo jelên PAGE şirove dikin. Ji ber ku reng hestiyarkerê ronahiyê ye, ronahîdana geş û dirêj a DNA ya rengkirî di hebûna oksîjenê de dikare guanînê oksîde bike û di dawiyê de qutbûnên biçûk di zincîran de çêbike; ev mekanîzma di xebata li ser oksîdasyona guanînê ya bi şîna metîlenê hestiyarkirî de bi hûrgulî hatiye şirovekirin. Dîtina kurt bi ronahiya spî ji zirara naskirî ya UV di rêbazên klasîk ên bromîda etîdyûmê de dûr dixe, û ev ji bo vegerandina preparatîf avantajeke rastîn e. Ronahiya xuya nermtir e, lê bêzirar nîne. Dema DNA dê bê klonkirin, ronahîdanê kurt bihêlin. Ji bo fotokîmyaya berfirehtir a pişt vê hişyariyê, li her du rêyên di fotokîmyaya şîna metîlenê de binêrin. Ji bo cotê redoksê û rewşên barê ku rave dikin çima forma oksîdekirî girê dide lê forma redûktekirî nadide, li kîmyaya avahî û taybetiyên şîna metîlenê binêrin.

Karê yekem: rengkirin di hundirê jelan de

Rengkirina jelê bersiva pirsê yekê dide: gelo di vê bendê de têra xwe asîda nukleîk heye ku bi çavan bê dîtin? DNA ya du-zincîrî di agarozê de rewşa herî baş hatiye taybetmendkirin e. Rêbaza orîjînal a jela şîna metîlenê ya Flores û hevkarên wî protokola bilez a 0.02 ji sed li ser agaroza 1 ji sed pejirand û vegerandin û klonkirina serketî ya piştî wê nîşan da. Heman protokola dabînkerê li rûpela hilbera şîna metîlenê ya IBI Scientific heye, ku reçeteya membranê ya 0.04 ji sed û guhertoya bilez a jelê li kêleka hev rêz dike.

Rêbaza kar a pratîk:

1. Elektroforeza jelê bi awayê asayî bikin. Piştî elektroforezê reng bikin, ne di dema wê de, heya ku veguhestin an hêza veqetandinê ji bo rêbazeke guhertî hatibe pejirandin.
2. Jelê bi hejandina nerm, nêzîkî 15 deqeyan di şîna metîlenê ya 0.02 ji sed w/v di ava distîlekirî de binuqînin.
3. Bi çend caran guhertina avê, bi giştî nêzîkî 15 deqeyan, rengê rakin, heta ku paşzemîna matrîsê kêm bibe û bend derkevin pêş.
4. Bê dereng li ser ronîkera ronahiya spî wêneyê bigirin.

Agaroz û polyakrilamîd bi awayên cuda tevdigerin. Agaroz rengê di matrîsê de digire, ji ber vê yekê rakirina rengê gava hêdî ye. Jelên tenik ên polyakrilamîdê zû reng dibin, lê rengê jî zû winda dikin; ev yek jêkirina preparatîf hêsan dike û zirarê dide tomarên arşîvî. Oligonukleotîdên sentetîk di polyakrilamîdê de dikarin bi heman reçeteya 0.02 ji sed di 20 heta 30 deqeyan de, bi şûştinên dubare yên avê, bên dîtin, li gorî rêbazên PAGE yên damezrandî yên şêwaza Current Protocols. Guhertoyên pir tenikkirî yên nêzî 0.0002 ji sed di TBE ya tenikkirî de ji bo oligoyên preparatîf di çend saetan de hatine raporkirin, lê bingeha delîlan qelstir e.

Cudahîya DNA û RNA girîng e. DNA ya du-zincîrî girêdana avahîdar a herî xurt dide. RNA û DNA ya yek-zincîrî reng dibin, lê qelstir û bi awayekî kêm pêşbînkirî. Ji bo jelên RNA yên agaroza formaldehîdê, piraniya laboratuvaran rengkirina şîn a di jelê de derbas dikin û pêşî RNA vediguhêzin membranê, paşê li wir reng dikin. Ev veguhestin sînyala qels a jelê bi sînyaleke zelaltir a membranê û tomareke barkirinê diguherîne.

Karê duyem: rengkirin li ser membranan

Rengkirina membranê bersiva pirseke cuda dide: gelo veguhestin serketî bû, û rêçik dikarin bên berawirdkirin? Bikaranîna klasîk rengkirina vegerbar a Northern blotê ya Herrin û Schmidt e; di destpêkê de 0.04 ji sed reng di 50 mM asetata sodyûmê de li pH 5.0 ji bo 2 heta 3 deqeyan, bi şûştina avê, dihate bikaranîn û berî hîbrîdîzasyonê bi SDS ya tenikkirî di SSPE de dihate rakirin.

Guhertoya nûjen a berfireh tê bikaranîn wiha dimeşe:

1. RNA an DNA ya denaturekirî biguhezînin naylon an nîtroselûlozê, paşê bi girêdana xaçî ya UV an germkirinê sabît bikin, da ku nimûne di dema rengkirinê de winda nebe.
2. Bijartî, lê gelemperî: membranê nêzîkî 15 deqeyan di asîda asetîk a 5 ji sed de şil bikin.
3. 5 heta 10 deqeyan di şîna metîlenê ya 0.02 heta 0.04 ji sed di 0.3 heta 0.5 M asetata sodyûmê de li nêzî pH 5.2 reng bikin.
4. Ji bo 5 heta 15 deqeyan bi avê bişon û rengê rakin, belge bikin, paşê berî hîbrîdîzasyonê rengê mayî jê bikin.

Naylona bi barê pozîtîf di xebatên Northern de serdest e. Nîtroselûloz jî bi heman rêbaza asîda asetîk û asetatê dixebite. Wêne ji bo piştrastkirina veguhestinê, berawirdkirina bendên 28S û 18S (an 23S û 16S ji bo RNA ya bakteriyan), nîşankirina pêpûk û standardan, û parastina tomareke texmînî ya normalîzekirina tevahiya RNA tê bikaranîn. Rêbazên Northern ên weşandî bendên rîbozomî yên rengkirî ji bo kontrolên barkirinê bi hejmaran dipîvin; di nav wan de xebateke zanista hilberên şîr heye ku bendên rîbozomî yên şîna metîlenê ji bo normalîzekirinê bikar anî. Membranên Southern dikarin bi heman awayî bên xuyakirin, lê reng wek kontrola barkirin û veguhestina Northern pir zêdetir hatiye pejirandin; DNA ya Southern jî berî veguhestinê tê denaturekirin, ji ber vê yekê hejmarên hestiyariya jelê li wir rasterast nayên sepandin.

Sînorên tespîtkirinê û paşzemîn: li ku şîn kêm dimîne

Berawirdkirina jêr bi zanebûn texmînî ye. Performansa rengê bi rêjeya jelê, firehiya bendê, optîk û dîsîplîna rakirina rengê ve girêdayî ye. Her hejmarê wek pîleyeke mezinahiyê bibînin, ne wek taybetmendiyeke diyarkirî.

Kontrola paşzemînê diyar dike ka sînyala sînordar dikare bê bikaranîn. Rengê azad pir bi reng e, ji ber vê yekê kontrast bi rakirina rengê negirêdayî bê rakirina rengê girêdayî pêk tê. Rengê bi konsantrasyona bilindtir kêm caran hestiyariyê zêde dike. Bi taybetî dema rakirina rengê zêde dike. Li ser heman jel, membran û kamerayê rêzeke tenikkirinê biceribînin, û tenê navbera ku tê de çiriya entegrekirî bi rêjeya têketî re rêjedar dimîne bikar bînin. Şîna metîlenê piştgirî dide normalîzekirina nîv-hejmarî ya barkirinê. Ew testeke hejmarî ya bi navbera dînamîk a bilind nîne, ji ber ku kapasîteya membranê, karîgeriya veguhestinê, têrbûn û rakirina rengê ji rêçikekê ber bi rêçikeke din ve diguhere.

Sînorên lihevhatinê: çi piştî rengkirinê dimîne

Klonkirina piştî rengkirina şîn hatiye nîşandan. Flores û hevkarên wî bendên agarozê yên rengkirî jê kirin, DNA vegerandin, ligasyon û transformasyona wê kirin, û klonkirineke baştir ji ya piştî bromîda etîdyûmê bi UV re rapor kirin. Sedema muhtemel zirara ronahiyê ya kêmtir e, ne sûdek ji rengê bixwe. Berketina bi ronahiya spî re kurt bihêlin û DNA ya vegerandî bi paqijkirina asayî ya derxistina ji jelê re derbas bikin.

Delîlên ji bo PCR û diyarkirina rêza nukleotîdan kêmtir in. Rengê mayî bi asîdên nukleîk ve girê dibe, ji ber vê yekê berî gavên enzîmî rengê rakin û paqij bikin. Tê hêvîkirin ku DNA ya ji jeleke şîn ku bi awayekî rast hatiye paqijkirin bixebite, lê asta toleransa veguhestina rasterast a rengê mayî di nav polîmeraz û kîmyayên diyarkirina rêzê de baş nehatiye pîvandin. Vê yekê wek tiştekî piştrast negirin.

Hîbrîdîzasyona blotê lihevhatî ye dema rêz bi hişkî bê parastin: veguhestin, sabîtkirin, rengkirin, belgekirin, rakirina rengê, hîbrîdîzasyon. Ev rêz sêwirana Herrin û Schmidt e. Rengkirina berî veguhestinê, an derbaskirina rakirina rengê, rêbazeke cuda ye û pejirandina xwe ya taybet hewce dike. Piştî rakirina rengê, rakirina standard a probê û kontrolkirina ji nû ve bi probê bi awayê asayî didomin. Ji bo rengkirina di asta şaneyê de bi heman malbata rengan û çima mantiqa fîlma sabîtkirî li rêbazên şaneyên zindî nayê sepandin, li atlasa rengkirina mîkroskopî binêrin.

Jêkirina bendan ji bo agaroza preparatîf û oligoyên PAGE yên bi şînê hatine dîtin dixebite, bi şertê ku ji guhertoya sabîtkirina mayînde bê dûrketin. Derxistina bi ceryana elektrîkê piştî rakirina rengê ji aliyê kîmyayî ve ji bo girêderekî vegerbar gengaz e, lê daneyên kontrolkirî yên berhemê ku taybetî şîna metîlenê ne kêm in. Piştî derxistinê xwê rakin an çökandinê bikin.

Pirsgirêkên ku dubare dibin

Bendên jelê yên kêmxuya bi gelemperî tê vê wateyê ku ji bo rengekî kolorîmetrîk girseyeke pir kêm heye, bi taybetî ji bo hedefên kurt ên yek-zincîrî an RNA. Zêdetir bar bikin, rengê nû bikar bînin, berî zêdekirina konsantrasyonê dema rengkirinê dirêj bikin, û rakirina rengê zûtir rawestînin. Jeleke bi tevahî şîn û bê kontrast bi gelemperî tê wateya rengkirina zêde an pir kêm guhertina avê. Dimirîna bendên PAGE kîmyayeke tê hêvîkirin e, ne rengkirineke têkçûyî. Zû wêneyê bigirin. Paşzemîna newekhev a membranê nîşana çîn, bilbil, şopa tiliyan, hejandina newekhev an veguhestina perçe-perçe ye. Bê kontroleke hîbrîdîzasyonê vê wek barkirina newekhev neşîrove bikin. Nexşeyeke rîbozomî ya belavbûyî û qels dikare têkçûna RNA nîşan bide, lê dikare ji veguhestina netemam, RNA ya giştî ya pir kêm (rêçikên asayî ji çend heta dehan micrograms dihewînin), an rakirina zêde ya rengê jî be. Reng RNA ya rîbozomî ya pir nîşan dide. Ew transkrîpteke taybet nîşan nade. Ev kar ê probê ye.

Ewlehî û karpêkirin bê îdiayên zêde

Karpêkirina şîna metîlenê ji ya bromîda etîdyûmê hêsantir e, lê ew bêzirar nîne. Belgeya heyî ya daneyên ewlehiyê ya MilliporeSigma rengê di Kategoriya 4 a jehrîbûna tûj a bi devê de dabeş dike, ku heke bê daqurtandin zirardar e; avêtina wê jî divê bi rêyeke pejirandî ya bermahiyan be, li gorî SDS ya şîna metîlenê ya Sigma-Aldrich. Bromîda etîdyûmê hişyariyên xurttir ên genotoksîsîteyê hildigire, di nav wan de bandorên gumanbar li ser şaneyên zayendî di SDS ya bromîda etîdyûmê ya Sigma-Aldrich de; jel û şaneyên wê jî bi gelemperî wek bermahiya kîmyayî ya xeternak cuda tên kirin, wek ku di rêbera rengên asîdên nukleîk a Thermo Fisher de hatiye destnîşankirin. Ji bo her duyan SDS û rêzikên sazgehê bişopînin. Rengê hişk di qabeke baş girtî û hişk de bihêlin, rengê kar tenê bi qasî ku protokol destûr dide ji nû ve bikar bînin, membranên rengkirî di navbera pelên fîltreyê de hişk hilînin, û berî ku bend bi belavbûnê winda bibin wêneyên jelan bigirin.

Hevoka maseya laboratuvarê bi bîr bînin. Jel xuyabûnê di barkirina bilind de li bin ronahiya spî test dikin. Membran veguhestin û barkirinê test dikin berî ku prob karê hestiyar bike. Yek reng her du karan pêk tîne, bi hestiyariya sînordar, girêdana vegerbar û rêza hişk a gavên kar.