Ceribandinên hevîrtirşkê bi şîna metîlenê: jimartina şaneyên zindî li hember pîvandina dema bêhndanê

Du lûle li ser maseya laboratuwarê ne. Her du jî şîn in. Di yekê de, şaneyên şîn di bin mîkroskopê de tê wateya hevîrtirşka mirî. Di ya din de, lûleyek ku ji şînê dibe bêreng tê wateya ku hevîrtirşk zindî ye û bêhnê distîne. Heman rengker, xwendinên berevajî hev. Ger van du ceribandinan tevlihev bikin, her encam berevajî dibe.

Ev cudahî mijara tevahiya gotarê ye. Şîna metîlenê rengkereke redoksê ye: di rewşa oksîdebûyî de şîn e, di rewşa redûkîrî de leukoşîna metîlenê ya bêreng e. Jimartina zindîbûnê di dîtineke mîkroskopî ya kurt de ji vê kîmyayê sûdê werdigire. Ezmûneke bêhndanê di reaksiyoneke bi giştî ya bi dempîvan de ji wê sûdê werdigire. Her yek pêdivî bi protokola xwe, kontrolên xwe û gumanbariya xwe heye.

Jimartina zindîbûnê: rengkirineke kurt, xwendina bê derengî

Protokola bi şêwaza çêkirina bîrayê guhertoya herî standardkirî ye. Şîna metîlenê ya 0.01% w/v di sîtrata sodyûmê ya 2% de amade bikin, wê bi rêjeya 1:1 bi suspansiyona hevîrtirşkê re tevlihev bikin û piştî navbereke kurt û sabît tevliheviyê binirxînin. Navberên weşandî ji 1 heta 2 deqîqeyan di destûra Enstîtuya Zanista Çêkirina Bîrayê de heta nêzîkî 5 deqîqeyan di protokolên lêkolînê de diguherin; rêbaza OIV ya mîkrobiyolojiya şerabê pêdivî dike ku vekolîn di nav 10 deqîqeyan de bê kirin. Konsantrasyona rengkerê di tevliheviya jimartinê de di dawiyê de nêzîkî 0.005% dibe. Odeyeke Neubauer a başkirî dagirin û li nêzîkî 400x şaneyên şînê tarî wek nezindî û şaneyên nerengkirî wek zindî dabeş bikin. Di rêbaza OIV de şaneyên şînê vekirî wek zindî tên hesibandin; ev jixwe îşaretê dide pirsgirêka nirxandina kesane ya ku li jêr tê nîqaşkirin.

Konsantrasyona şaneyan ji geometriya odeyê tê derxistin. Dema ku çargoşeya navendî ya 1 mm bi tevahî tê jimartin, hejmara şaneyan di her mL de wekhevî N car faktora tenikkirinê car 10^4 e; N hejmara şaneyên di wê qadê de ye, wek ku di rêbazên ASBC yên hevîrtirşkê de hatiye diyarkirin. Zindîbûn hêsantir e: hejmara şaneyên nerengkirî li hejmara giştî ya şaneyan dabeş bikin, paşê bi 100 zêde bikin. Ji bo texmîna zindîbûnê nêzîkî 400 şaneyan bijmêrin, li gorî lêkolîna berawirdkirinê ya FEMS di çêkirina bîrayê de û pratîka OIV. Yek qaîdeya sînorê bi berdewamî bi kar bînin; mînak, şaneyên li ser xetên jêr û çepê yên torê bijmêrin û yên li ser xetên jor û rastê nehesibînin.

Berî destpêkirina jimartinê divê ji bo bişkojkan qaîdeyek bê danîn. Li gorî adeteke berbelav, dema bişkojk dighêje nêzîkî nîvê mezinahiya şaneya dayikê, wek şaneyeke cuda tê jimartin; heke ji wê biçûktir be, bi dayikê re tê hesibandin. Kîjan qaîde bê hilbijartin jî, wê di her çargoşeyê de bi kar bînin û li ser pelê xebatê binivîsin da ku kesê din heman tiştî dubare bike.

Pelê xebata jimartinê (vê çap bikin)

Ev pelê xebatê materyaleke resen a vê gotarê ye. Wê di defterekê de kopî bikin an jî ji bo her nimûneyê yekê çap bikin.

Zindîbûn (%) = 100 x nerengkirî / (nerengkirî + şînê tarî). Hejmara giştî ya şaneyan di her mL de = N x faktora tenikkirinê x 10^4, ku N ji qada diyarkirî ya odeyê tê. Navbera rengkirinê li kêleka encamê tomar bikin, ji ber ku hejmareke zindîbûnê bê agahiya demê nayê dubarekirin.

Çima hejmarên zindîbûnê diguherin

Dem faktorê yekem ê tevlîhevker e û bandora wê di her du aliyan de heye. Şaneyên ji aliyê metabolîzmê ve çalak rengkerê redûkîr dikin; ji ber vê yekê, xwendineke zû dikare şaneyên zindî berî ku redûksiyona wê biqedînin bibîne û bi xeletî wek mirî dabeş bike. Lê rûbirûbûna dirêj bi xwe jehrîn e û şaneyên şîn ên bi rastî zirardîtî çêdike, ku dibe sedema rengkirina xelet a mirinê. Ji ber vê yekê, protokoleke hînkirinê ya laboratuwarê diyarkirina encaman di nav 5 deqîqeyan de destnîşan dike, wek ku di protokoleke hînkirina hevîrtirşkê ya Wisconsin de hatiye belgekirin. Gotina ewle ev e ku nirxandina bi şîna metîlenê bi demê ve girêdayî ye; ji ber vê yekê, navbereke kurt diyarkirî hilbijêrin û wê di her nimûneya rêzekê de sabît bihêlin.

Nimûneyên bi zindîbûna kêm xwarbûneke duyem a nirxandinê bi xwe re tînin. Rêbaza standardkirî hişyar dike ku şîna metîlenê li jêr nêzîkî 80% dikare zindîbûna rastîn ji ya rast zêdetir texmîn bike, ji ber ku ne şert e şaneyên ku hîn rengkerê redûkîr dikin karîna zêdebûnê biparêzin. Edebiyata çêkirina bîrayê heman nebawerbarîyê dema ku zindîbûn bi awayekî berçav kêm dibe vedibêje. Şîna metîlenê wek texmîneke zû û nêzîkî bi kar bînin û biryarên girîng ên derbarê zindîbûna kêm de, wek ji nû ve bikaranîna çandekê ji bo fermantasyonê, bi jimartinên li ser plakan an rengkirineke temamker piştrast bikin.

Bandorên matrîksê di rêza sêyem de ne. Rêbaza OIV li nêzîkî pH 4.6 tê meşandin û hişyar dike ku nimûneyên bi pH kêm û tamponkirina xurt rê li ber reftara rast a rengkerê digirin. Herwiha pêşniyar dike ku ceribandin li jor 100 g/L şekir neyê bikaranîn, ji ber ku şane bi awayekî xapînok şînê vekirî xuya dikin. Berawirdkirineke ezmûnî ya pH ya rengkirinê dît ku hestiyarî di navbera ceribandî de bi awayekî berçav diguhere; ev bi lêkolîneke rêbaza şîna metîlenê ya bi pH ve girêdayî re li hev tê. Bermahî xefikeke cuda ye: perçeyên rengkirî di tevliheviyên genim ên qirêj de şaneyên mirî dişibînin û cudahiya encaman di navbera xebatkaran de zêde dikin.

Ev cudahî hatiye pîvandin, ne tenê çîrokên kesane ne. Di ceribandineke şeş mehî ya çêkirina bîrayê de, ku di berawirdkirina hevîrtirşkê ya FEMS de hatiye raporkirin, devyasyona standard a navîn a pîvandinên dubare yên bi şîna metîlenê 6.1% bû, li hember 0.2% ya sîtometriya herikînê bi oxonol. Encama du xebatkaran li ser heman nimûneyê heta 13 xalên ji sedî ji hev cuda bû. Berawirdkirineke hejmarî ya rêbazên zindîbûnê ya 2023 dît ku mîkroskopiya floresansê û sîtometriya herikînê gelek hûriktir in, lê herwiha nîşan da ku performans bi cureyê û matrîksê ve girêdayî ye. Danasîna klasîk a rêbazê ji aliyê Painting û Kirsop (PMID 24430080) ve hîn xala referansê ye, û nirxandineke berfirehtir a ceribandinên zindîbûn û çalakiya hevîrtirşkê (PMID 25154541) şîna metîlenê di nav ceribandinên temamker de bi cih dike, ne yên qetî. Şîna trîpanê li vir ne başkirineke otomatîk e: ew windabûna yekparebûna perdeya şaneyê nîşan dide, lê şîna metîlenê ketina rengkerê tevî çalakiya redûksiyonê nîşan dide. Ji ber vê yekê, şaneyên di bin stresê de dikarin bi van du rengkeran bi awayên cuda bên dabeşkirin.

Ezmûna bêhndanê: dema windabûna şînê bipîvin

Ceribandina duyem qet bi mîkroskopê nayê xwendin. Hevîrtirşk tevî glukoz û şîna metîlenê ya tenik dikeve lûleyeke girtî, û dempîv dirêjahiya dema windabûna şînê dipîve. Dema şane metabolîzmayê dimeşînin, ekvîvalentên redûkîrker çêdikin ku rengkerê şîn vediguherînin forma wê ya bêreng, lê oksîjena helbûyî wê ji nû ve oksîde dike û şîn dike. Dema şane oksîjenê kêm dikin, redûksiyona net serdest dibe û lûle bêreng dibe. Ji ber vê yekê, xala dawî hevsengiya bêhndanê, konsantrasyona rengkerê û hebûna oksîjenê nîşan dide. Divê ew wek dema redûksiyon an bêrengbûna şîna metîlenê bê raporkirin, ne wek rêjeya rasterast a xerckirina oksîjena molekulî.

Ji ya xebata zindîbûnê rengkereke gelek teniktir bi kar bînin da ku dema pîvandinê bikeve navbereke guncaw. Destûra pratîkên pêwîst a AQA A level vê baş standard dike: 1 g glukoz di her 100 mL avê de ku heta nêzîkî 30 C hatiye germkirin, 5 g hevîrtirşka hişkkirî ku yekser berî bikaranînê tê zêdekirin, û rengkereke xebatê ya nêzîkî 0.001% ku bi tenikkirina 0.1 mL ji stokeke 1% heta 100 mL tê amadekirin. 2 mL suspansiyona hevîrtirşk-glukozê bi 2 mL rengkerê xebatê re tevlihev bikin, bihêlin ku bigihêje hevsengiyê li germahiya ceribandinê, carekê ji bo 10 çirkeyan bihejînin, dempîvê bidin destpêkirin û êdî nehejînin. Hejandin oksîjenê ji nû ve dixe navê û lûleyê dîsa şîn dike; ev mezintirîn bandora çêkirî ya prosedurê ye. AQA têbînî dike ku amadehî divê bi gelemperî li 35 C di nav nêzîkî 5 deqîqeyan de bêreng bibe; navînên ceribandinê 275 s li 20 C, 128 s li 35 C û 145 s li 45 C ne. Ev mînakên ji yek sazkirinê ne, ne pîvanên gerdûnî ne. Girêdana hejmarî ya di navbera rêjeya redûksiyonê û hevîrtirşka ji aliyê metabolîzmê ve çalak de di şertên kontrolkirî de bi lêkolînên taybet ên redûksiyonê tê piştgirîkirin; di nav wan de xebata bi PMID 25773544 hatiye tomar kirin û lêkolîna mekanîzmayê di Yeast (2014) de hene.

Nîşandana pêvajoya demê (materyala resen)

Tabloya jêr nîşandaneke resen e ku ji bo vê gotarê bi sazkirina bi şêwaza AQA ya li jor hatî vegotin hatiye çêkirin: 2 mL tevliheviya hevîrtirşk-glukozê tevî 2 mL rengkerê xebatê ya nêzîkî 0.001%, hejandineke 10 çirkeyî, paşê înkubasyona bê destlêdan. Têketin xwendinên mînak in di forma ku komeke xwendekaran divê tomar bike de; nîşandera rêjeyê wek 1 dabeşî dema bêrengbûnê bi çirkeyan tê pênasekirin. Ceribandinê bi heman lûleyan bimeşînin û van têketinan bi nirxên pîvandî biguherînin.

Ji bo lûleyên A, B û C grafîka nîşandera rêjeyê li hember germahiyê çêkin. Kevî bilind dibe, paşê dûz dibe an dadikeve; ev şêwaza tê hêvîkirin a bi enzîman tê rêvebirin e, ne xeteke rast e. Lûleyên D, E û F li ser wê keviyê ne xalên daneyan in. Ew kontrolên ku şirovekirina keviyê mimkun dikin in.

Kontrolên ku wateyê didin her ceribandinê

Her meşandina ceribandina bêhndanê pêdivî bi sê hevalan heye. Hevîrtirşka kelandî an kuştî tevî glukoz û rengkerê divê şîn bimîne; ev piştrast dike ku redûksiyona bilez bi metabolîzmaya zindî ve girêdayî ye. Hevîrtirşka zindî tevî rengkerê, bê glukoza lêzêdekirî, kontrola substratê ye; lê dîsa jî li benda bêrengbûneke hêdî bin, ji ber ku hevîrtirşk rezervên xwe yên navxweyî dixercîne. Glukoz tevî rengkerê bê hevîrtirşk nimûneya vala ya kîmyayî ye; ev girîng e ji ber ku glukoza alkalîn dikare şîna metîlenê bê hebûna tu şaneyan redûkîr bike.

Jimartina zindîbûnê pêdivî bi cureyeke din a kontrolê heye: sabîtbûna prosedurê. Heman stoka rengkerê, heman rêjeya tevlihevkirinê, heman navbera rengkirinê, heman qada odeyê, heman qaîdeyên bişkojk û sînorê; li cihên mimkun, jimartin bê zanîna nasnameya nimûneyê. Dema ku du xebatkar bi deh xalan ji hev cuda encam didin, pelê xebatê bi gelemperî sedemê eşkere dike: demên cuda, astên cuda yên şînê ji bo dabeşkirinê, an qaîdeyên cuda yên bişkojkan. Teknîkên amadekirin û dîtina şaneyên rengkirî bi rêbazên rengkirina sade ya bakteriyan ve girêdayî ne; lê nihêrîneke berfirehtir li tiştên ku rengker di nimûneyên cuda de nîşan dide di atlasa rengkirina mîkroskopî de heye. Ji bo fîzîka li pişt xwendina hejmarî ya her tundiya şînê, referansa têkişandinê ya ku şertên wê hatine destnîşankirin şirove dike çima divê her koefîsyent bi şertên xwe yên helker, pH û konsantrasyonê re bê dayîn.

Ceribandinê li gorî pirsê hilbijêrin. Niha çend şane zindî ne, pirseke jimartinê ye ku bi mîkroskop û pelê xebatê tê bersivdan. Ev çand bi çi astê bêhnê distîne, pirseke kînetîk e ku bi dempîv û lûleyên kontrolkirî tê bersivdan. Şîna metîlenê ji bo her duyan tê bikaranîn, lê qet di heman lûleyê de di heman demê de na.