Pîvandina cureyên reaktîf ên oksîjenê di ceribandinên şîna metîlenê de

Du laboratuvar ceribandinekê dikin ku her yek jê re ceribandina antîoksîdan a şîna metîlenê dibêje. Yek radigihîne ku boyax cureyên reaktîf ên oksîjenê kêm dike. Ya din radigihîne ku wan çêdike. Her du jî kêşaneyên bersiva dozê yên zelal nîşan didin. Her du jî dilpak in. Cudahî ne sextekariyê ye û ne jî bêşarezayî ye. Sedem ew e ku her du koman di bin roniyên cuda de tiştên cuda pîvandine, bi sondên ku bersiva pirsên cuda didin, û paşê her du bersiv bi heman peyvê rave kirine: ROS.

Şîna metîlenê molekuleke dijwar e ji bo pîvandina hûr, ji ber ku ew beşdarî kîmyaya ku divê çavdêriya wê bike dibe. Di tariyê de elektronan di navbera bexşîner û wergiran de vediguhezîne û vedigere forma xwe ya destpêkê, amade ye ku dîsa bikeve çerxê. Di bin roniyê de dibe fotosensîtîzeker, digihîje rewşeke trîplet a heyecankirî ku ji wê dikare enerjiyê bide oksîjenê û oksîjena sînglet çêbike, an elektronan veguhezîne û radîkal û peroksîda hîdrojenê çêbike. Her sondek ku di wê pergalê de tê danîn dikare ji hêla boyaxê bi xwe ve bê oksîdkirin, redûksiyonkirin, bêrengkirin an ji aliyê optîkî ve bê veşartin. Ji ber vê yekê, pirsa yekem a her pîvandina ROS qet ne ew e ku hejmar çi ye. Pirsa yekem ew e ku test bi rastî çi tespit dike, û boyax çi li testê dike.

Amplex Red: testeke kalîbrekirî ya peroksîda hîdrojenê

Kombînasyona şîna metîlenê û Amplex Red di vê wêjeya zanistî de hevberdana herî baş a ku dikare bê parastin e, dema ku bi awayekî rast tê sazkirin. Kîmya taybet e: peroksîdaza horseradishê peroksîda hîdrojenê bi kar tîne da ku substrata Amplex bi stoykîyometrîyeke nêzîkî yek bi yek oksîd bike û biguhezîne hilbereke floresan, resorufin. Peroksîda di nimûneyê de li detektorê dibe floresans. Tu endamekî din ê malbata ROS ya standard vê reaksiyonê rasterast naxe tevgerê.

Avantaja diyarker kalîbrasyon e. Lêkolînerekî bi baldarî standardên peroksîdê yên naskirî di heman tamponê de, bi heman konsantrasyonên peroksîdazê û substratê, heman dema înkubasyonê û heman mîhengên optîkî diceribîne, paşê nimûneyan li gorî wê kêşaneyê dinirxîne. Di lêkolîna mîtokondrîyên veqetandî yên mêjî de, ku bingeha vê rêbazê ye, nivîskaran bi rastî ev kir: di dawiya her gerê de miqdarên naskirî yên peroksîdê zêde kirin, û hejmar ne wekî yekeyên kêfî yên floresansê, lê wekî rêje bi pîkomol di her deqeyê de ji bo her mîlîgrama proteînê hatin ragihandin. Ev e ya ku biriqînê vediguhezîne pîvandinê.

Sê hûrguliyên wê lêkolînê hêjayî dubarekirinê ne. Yekem, nivîskaran sînyal bi katalazê piştrast kirin; katalaz peroksîdê tune dike. Dema katalaz hat zêdekirin, zêdebûna floresansê ya ji hêla şîna metîlenê ve hatibû çêkirin rawestiya; ev yek piştrast kir ku sînyal ji peroksîdê bû, ne artefakteke optîkî. Duyem, wan ronîkirin rasterast ceriband û tîrêja heyecankirinê bi perdeyekê sînordar kir, da ku nimûne tenê yek ji heştê doza asayî ya roniyê bistînin; sînyal tenê ji sedî neh kêm bû. Zêdetir ji sedî nodê peroksîda ku wan ragihandibû ji ronahiya pîvandinê serbixwe bû. Sêyem, wan rakirina peroksîdê bi elektrodeke cuda pîvand û dît ku boyax hem hilberînê zêde dike hem jî rakirinê hêdî dike. Sondek ku tenê floresansa net radigihîne dê van du bandoran bi hev re tevlihev bikira.

Test hîn jî xwedî rêyên têkçûnê ye, û şîna metîlenê gelek ji wan derdixe holê. Boyax di heman herêma sor de ku resorufin tê de roniyê derdixe, bi berfirehî roniyê dimije; ji ber vê yekê, di konsantrasyonên bilind ên boyaxê de nimûne dikare bi bandorên fîltreya hundirîn sînyala xwe veşêre. Ji ber vê yekê divê standard heman konsantrasyona boyaxê ya nimûneyan bihewînin. Amplex Red dikare bi xwe jî bi roniyê bê oksîdkirin, û hilbera wê resorufin dikare bikeve çerxên fotoredoksê yên ku sûperoksîd û peroksîdê çêdikin; dema ceribandin fotosensîtîzekerekê jî ronî dike, ev yek pir girîng e. Çareseriya pratîk ew e ku pêşî nimûneyên şîna metîlenê bên tîrêjandin û paşê beşên ji wan hatine veqetandin di tariyê de bi reaktîfên Amplex bên ceribandin, ne ku boyax û sond bi hev re bên ronîkirin. Di dawiyê de, dîsmûtaza sûperoksîdê tenê sînyala Amplex kêm nake: veguherandina sûperoksîdê bo peroksîdê dikare wê zêde bike. Kontroleke SOD ku floresansê zêde dike têk neçûye. Wê sûperoksîd wekî cureyekî di qonaxeke berê ya rêya reaksiyonê de nas kiriye.

DCFDA: nîşandereke netaybet a oksîdasyonê

Hevberdana şîna metîlenê û DCFDA çavkaniya piraniya tevliheviyê ye. DCFH-DA pêşmadeyek e ku ji bo barkirina hundirê şaneyê tê bikaranîn. Esterazên di hundirê şaneyê de komên asetatê jê radikin û DCFH ya bêfloresans dihêlin; oksîdasyona DCFH jî DCF ya floresan çêdike. Lîsteya tiştên ku wê oksîd dikin dirêj e: radîkalên hîdroksîlê, navberên peroksîdazê û hemê, dîoksîda nîtrojenê, asîda hîpokloroz û radîkalên ji peroksînîtrîtê hatine çêkirin. Peroksîda hîdrojenê bi tena serê xwe wê rasterast bi rêjeyeke bikêrhatî oksîd nake; floresansa girêdayî peroksîdê bi gelemperî hewce dike ku hesin, proteînên hemê an kîmyaya peroksîdazê di çerxê de hebin.

Rexneya ku divê her beşa rêbazan jê referans bide, ji analîza DCFH wekî sond ji hêla Kalyanaraman û hevkarên wî ve tê, wekî ku di lêkolîna mîtokondrîyên mêjî ya ku ji ber vê sedemê DCFDA red kir de hatiye kurtekirin. Wan nîşan da ku ev sond hêdî reaksiyonê dike, bi stoykîyometrîyeke ku nehatiye diyarkirin, bê kalîbrasyoneke derbasdar û bi pêkhateyên ku ne ROS in. Sond her wiha tiştê ku dipîve xurt dike: oksîdasyona DCFH bi windakirina elektronekê radîkaleke DCF çêdike ku bi oksîjenê re reaksiyonê dike û sûperoksîdê çêdike; sûperoksîd jî bi dîsmûtasyonê dibe peroksîda zêde. Pîvandin bi qismî kîmyaya ku radigihîne bi xwe çêdike.

Tu yek ji van tiştan DCFDA bêkêr nake. Ew wê dikin amûreke pêşnirxandinê, ne amûreke naskirinê. Zêdebûna floresansa DCF tê wê wateyê ku oksîdasyona sondê ya girêdayî oksîdkeran zêde bûye. Ev nayê wê wateyê ku peroksîd zêde bûye, û bêguman nayê wê wateyê ku ROS ya giştî zêde bûye; ew miqdarek e ku tu sondeke tenê napîve. Xebatên berê yên şîna metîlenê yên ku li konsantrasyonên ji yek mîkromolar bilindtir xwe dispêrin oksîdasyona DCF, bandorên prooksîdan ragihandin, dema ku pergalên din di heman serdemê de parastina li dijî mirina şaneyan a ji hêla peroksîdê ve hatiye çêkirin ragihandin. Her du çavdêrî dikarin ji bo heman boyaxê di şertên redoksê yên cuda de rast bin, û encama DCF bi tena serê xwe nikare bibêje kîjan oksîdker sînyal çêkiriye. Girîngiya xebata berê ya mîtokondrîyên mêjî ew e ku wê li şûna vê pêşnirxandinê pîvandineke kalîbrekirî ya peroksîdê bi kar anî û barê wê rasterast dît: heta sed nanomolar boyax jî di hemû substrat û rewşên respirasyonê yên hatine ceribandin de berdana peroksîdê çend qat zêde kir.

DCFDA xwedî xefikeke din jî ye ku ji şîna metîlenê re taybet e. Boyax pir bireng e û ji aliyê redoksê ve çalak e; ji ber vê yekê dikare floresansê bêreng bike, derdana roniyê bitepisîne an kîmyaya sondê serbixwe ji ROS ya şaneyê oksîd bike. Kontroleke bêşane ya boyax bi sondê re û bê şane ne xemilandineke vebijarkî ye. Ew ceribandin e ku ji we re dibêje ka boyax bi sondê re têkiliyê dike yan na.

Girtina spînê û wergirtina oksîjenê: nasname û herikîn

Li cihê ku sondên floresan radigihînin ku tiştekî ku dikare bê oksîdkirin derketiye holê, rezonansa spîna elektronê bi girtkerên spînê agahiyeke nêzîktir li ser nasnameya wî tiştî dide. Lêkolîna klasîk a fotokîmyaya şîna metîlenê ESR bi kar anî da ku radîkala askorbatê ya ji boyax, askorbat û roniyê tespit bike, paşê di ceribandinên wergirtina oksîjenê de çêbûna peroksîdê û di ceribandinên girtina spînê de çêbûna radîkala hîdroksîlê ya bi katalîza hesinê nîşan da. Her teknîkê bersiva pirsa ku yên din nikarîbûn bidin da: ESR nasnameya radîkalê da, wergirtina oksîjenê herikîna reaksiyonê serbixwe ji her sondeke floresan da, û kombînasyonê nîşan da ku di heman pergala ronîkirî de hem rêyên oksîjena sînglet hem jî rêyên radîkalan dixebitin.

Encama sala 1984 hîn jî wekî etîketeke hişyariyê tê xwendin. Di hebûna ronîkirinê û madeyeke redûksiyonker de boyax peroksîd çêkir, û di hebûna hesinê de pergalê radîkala hîdroksîlê, cureya herî reaktîf a di vê komê de, çêkir. Nivîskaran ev yek bi askorbata di çavê de ve girêda û bikaranîna wê ya bêbaldarî di çavan de xist bin pirsê. Divê xwînerên îro şertan ji bîr nekin: ronî bi redûksiyonker û hesinê re. Her yek ji wan rakin, rêya reaksiyonê lawaz dibe an ji holê radibe.

Elektrodên oksîjenê bi awayekî din cihê xwe bi dest dixin. Elektrodeke ji cureyê Clark xerckirina net a oksîjenê dipîve; ev piştrast dike ku kîmyaya redoksê ya bi boyaxê tê ajotin oksîjena molekulî xerç dike, û agahiyên kînetîkî dide ku tu artefakteke floresansê nikare sexte bike. Ew hilberê nas nake. Çêbûna peroksîdê, sûperoksîdê û avê, û hilweşîna oksîjena sînglet hemû oksîjenê xerç dikin. Herikîn bê nasname bi qasî nasnameya bê herikîn ne temam e; ji ber vê yekê gotarên bihêz elektrodê bi testeke kalîbrekirî ya peroksîdê an bi girtkerekê re bi kar tînin.

Çima encamên antîoksîdan li hev nakin

Gava her sê encamên pîvandinê li kêleka hev têne danîn, nakokiyên xuya di wêjeya zanistî ya şîna metîlenê de dibin cudahiyên rêbazê û sê rastiyên biyolojîk.

Yekem, boyax hem veguhezînerê elektronan e hem jî çavkaniya peroksîdê ye. Bi dûrxistina elektronan ji cihên respirasyonê ku oksîjen dê li wan bibe sûperoksîd, dikare yek ji cureyên ROS kêm bike, di heman demê de forma wê ya redûksiyonkirî oksîjenê rasterast dike peroksîd û cureyeke din zêde dike. Ji ber vê yekê, divê laboratuvareke ku bi kîmyaya redoksê ya mîtokondrîyan û rola wê ya rêya alternatîf re dixebite li benda bersivên girêdayî sondê be: di heman kûvetê de encama pîvandina hestiyar li sûperoksîdê kêm dibe, lê encama pîvandina peroksîdê zêde dibe.

Duyem, peroksîd di dozên kêm de sînyal e, ne tenê zirar e. Lêkolîna mîtokondrîyên mêjiyê mişkan a ku piştî xebata berê hat kirin, çêbûna peroksîdê heta bi pêncî nanomolar boyax, bê lezyonên DNA ya mîtokondrîyan di astên terapotîk de dît, û piştî pêşdermankirinê parastina li dijî lezyonên ji hêla rotenonê ve hatine çêkirin dît. Tenê li sed mîkromolar, pir li jor rêza terapotîk, boyaxê zirar da parçeyên DNA yên hilbijartî; ronahiya sor bi bîst mîkromolar boyax re jî oksîjena sînglet çêkir ku zirar da hemû parçeyên hatine ceribandin. Mekanîzmaya pêşniyarkirî hormetîk e: hilberîna sivik a peroksîdê parastinên antîoksîdan ên girêdayî Nrf2 û biyogeneza mîtokondrîyan çalak dike; ji ber vê yekê, encameke prooksîdan a demkurt li pêş encameke antîoksîdan a demdirêj tê. Testeke piştî saetekê tê xwendin û testeke piştî rojekê tê xwendin dikarin li hev nekin, ji ber ku di navbera wan de biyolojî guheriye.

Sêyem, ronî diyar dike ka kîjan molekul bi rastî heye. Ronîkirin komên metîlê ji boyaxê radike û wê ber bi Azure B û hilberên têkildar ve vediguhezîne; ronahiya mikroskopê li ser firaxekê jî têrê dike ku wê ji aliyê fotosensîtîv ve çalak bike. Ceribandinên di tariyê de û yên di roniyê de ceribandinên cuda ne, û divê beşa kontrolên ronîkirinê û xebitandina boyaxê ya her protokolê bi wan wekî ceribandinên cuda re tevbigere.

Komeke herî kêm a kontrolan, û awayê xwendina her îdiayê

Berawirdkirina li jêr materyala referansê ya orîjînal a vê gotarê ye. Berî ku hûn her encameke ROS ya şîna metîlenê qebûl bikin, kontrol bikin ka nivîskaran kîjan rêz dagirtiye û kîjan derbas kiriye.

Ji vê qaîdeyeke pratîk a xwendinê derdikeve. Amplex bi peroksîdazê re, kalîbrekirî û bi kontrola katalazê, delîleke li ser peroksîdê ye. DCFDA delîleke li ser oksîdasyona netaybet a sondê ye û ne tiştekî zêdetir. Girtina spînê bi kontrolên madeyên radîkal-gir re delîleke li ser nasnameya radîkalê ye. Wergirtina oksîjenê delîleke li ser herikînê ye. Hevokek ku tiştekî zêdetir ji wê yekê îdia dike ku testa wê dikare piştgirî bike, çiqas bi baweriyeke mezin jî hatibe nivîsandin, hevokeke li ser sondê ye, ne li ser boyaxê. Nîqaşên têkildar li ser girêdayîbûna bi dozê û rêza hormetîk, herikîna elektronan a mîtokondrîyan, destwerdana testê di nimûneyên boyaxkirî de û artefaktên ronîkirinê yên mikroskopiyê her yek ji van xalan berfireh dikin, û her yek piştî guherandina referansa cihgira xwe jî derbasdar dimîne.