Pîvandina bandorên şîna metîlenê li ser mîtokondriyan: oksîjen, ATP û potansiyela membranê

Bifikirin ku laboratûwarek şîna metîlenê li mîtokondriyên ku bêhnvedana wan têk çûye zêde dike û dibîne ku vexwarina oksîjenê zêde dibe. Hevoka ku mirov bi xwezayî dixwaze binivîse ev e ku boyaxê fonksiyona mîtokondriyan vegerandiye. Dibe ku ev hevok şaş be. Herikîna oksîjenê, senteza ATP û potansiyela membranê sê têgehên cuda ne. Ew heman organelê parve dikin, wekî kopîkirina ewlehiyê, hevdemkirin û parvekirinê heman peldanka ewrê parve dikin: bi hev ve girêdayî ne, lê bi qaîdeyên cuda tên rêvebirin. Ger yekê bi ya din re tevlihev bikin, şîrove têk diçe, heta dema ku hemû pîvandin ji aliyê teknîkî ve rast bin.

Şîna metîlenê vê tevliheviyê muhtemel dike, ji ber ku ew beşdarî pergala ku tê pîvandin dibe. Ew madeyeke ku dikeve çerxa redoksê ye; li beşa pêşîn a rêyê elektronan qebûl dike û li beşa paşîn wan dide. Ew katyoneke lîpofîlîk e ku di mîtokondriyên enerjîdar de kom dibe, û pêkhateyeke bi rengê şîn ê xurt e ku di heman bandên sondên berbelav de ronahiyê hildigire û diweşîne. Yek encama xwendinê nikare vê barê hilgire. Şêwaza bawerbar, ku di lêkolînên mîtokondrî yên Budapestê de hatiye nîşandan, ev e ku herikîna oksîjenê bi leza senteza ATP, potansiyela membranê û berdana peroksîda hîdrojenê re were pîvandin, û di her gavê de kontrolên taybet ên boyaxê bên bikaranîn.

Respîrometrî herikîna oksîjenê dipîve, ne derketina enerjiyê

Respîrometriya bi hûrguliya bilind, çi bi Oroboros Oxygraph çi bi analîzkerê herikîna derveyî şaneyê yê Seahorse, tenê yek tişt radigihîne: oksîjen bi çi lezê tê reduktekirin. Ew nabêje ka ji bo her elektronê çend proton hatine pomp kirin, çiqas gradyan hatiye parastin, an ka ATP sentazê ew bi kar aniye yan na.

Peyvên ku tên bikaranîn girîng in. Di mîtokondriyên veqetandî de, substrat bê ADP bêhnvedana rûniştinê dide, substrat bi ADP ya têrker kapasîteya fosforîlasyona oksîdatîf dide, û tîtrasyona madeya jihev-veqetîner kapasîteya herî zêde ya veguhastina elektronan dide. Di şaneyên saxlem de, hevwateyên Seahorse ev in: bêhnvedana bingehîn, bêhnvedana girêdayî ATP ya hesas li oligomycinê, rûniştina protonan, bêhnvedana herî zêde ya ku bi FCCP tê diyarkirin, û vexwarina oksîjenê ya ne-mîtokondrî ku li hember rotenone û antimycinê berxwedêr e. Binavkirina encamên Seahorse wekî State 3 û State 4 hûrguliyeke ku amadekarî piştgirî nade wan têgehan vediguhezîne, wekî çarçoveya Mito Stress Test a Agilent eşkere dike.

Şîna metîlenê têkiliya ku mirov bi xwezayî di navbera oksîjena zêdetir û enerjiya zêdetir de dibîne dişkîne. Li gorî lêkolîna mîtokondriyên mêjî yên veqetandî, di mîtokondriyên veqetandî yên mêjiyê berazê Gîneyê de, boyaxa bi konsantrasyona 100 nM heta 1 uM vexwarina oksîjenê ya di rewşa bêçalakkirinê de bi substratên glutamate tevî malate, succinate û alpha-glycerophosphate zêde kir; bi alpha-glycerophosphate re zêdebûn nêzî 64 ji sed bû. Lê bêhnvedana bi ADP hatî teşwîqkirin di mîtokondriyên saxlem de bi bingehî neguherî. Ji ber ku rûniştin zêde bû lê herikîna bi ADP hatî teşwîqkirin heman ma, rêjeya kontrola bêhnvedanê ya hesabkirî kêm dibe. Ev kêmbûn nayê wê wateyê ku boyaxê zirar daye mîtokondriyan. Wateya wê ev e ku boyaxê li ser bêhnvedana asayî çerxeke redoksê ya oksîjen-vexwer zêde kiriye. Ceribandineke vexwarina oksîjenê ya şîna metîlenê ku tenê zêdebûnê radigihîne, kîmyayeke rastîn pîvandiye lê tiştek li ser parastina enerjiyê negotiye.

Ceribandinên vegerandina fonksiyonê heman ferqê di asteke mezintir de nîşan didin. Dema Komplekse I hat astengkirin, herikîna oksîjenê nêzî sê qat vegeriya, lê senteza ATP tenê nêzî 1.5 qat vegeriya. Oksîjena zêdetir gihîşt elektrodê. Beşeke kêmtir ji wê ji bo hilberîna ATP hat bikaranîn. Her îdiaya baştirbûna fosforîlasyona oksîdatîf hewceyê aliyê ATP yê vê hesabê ye; ya îdeal ew e ku wekî rêjeya ATP ji bo her oksîjenê bê vegotin û rêbaza diyarkirina mexrecê jî bê eşkerekirin.

Ceribandinên ATP leza sentezê dipîvin; mîqdara heyî nikare şûna wê bigire

Ceribandina ATP bersiva pirseke cuda dide: di her yekîneya demê de çiqas ATP tê hilberandin. Xwendineke kînetîk, çi bi şopandina lumînesansa lûsîferaza agirpêskê di nav çend deqeyan de çi bi ceribandina enzîmî ya hev-girêdayî ya hexokinase tevî glucose-6-phosphate dehydrogenase ku li 340 nm tê xwendin, lezê dide. Pîvandineke yekcarî ya ATP ya tevahî li xala dawiyê mîqdara heyî dide; ev mîqdar sentezê ji vexwarinê kêmtir nîşan dide û bi serê xwe li ser fosforîlasyona oksîdatîf kêm agahî dide.

Koma Budapestê rêbaza enzîmî ya hev-girêdayî bi astengkirina adenylate kinase bi kar anî û dît ku şîna metîlenê bi konsantrasyona 1 heta 2 uM hilberîna ATP di mîtokondriyên bi rotenone û antimycinê hatî muamelekirin de bi awayekî kêm lê girîng zêde kir. Ev vegerandineke rastîn a fonksiyonê ye, lê qismî ye. Lêkolîna jehrîbûna TEGDMA di modelekî din de gihîşt heman şêweya bersivê: monomera diranan TEGDMA bi konsantrasyona 5 mM bêhnvedana girêdayî Komplekse I ji nêzî 286 yekîneyên herikînê daxist 28, û boyaxa bi konsantrasyona 2 uM ew vegerand nêzî 86.

Bi pêkhateyeke rengîn a redoksê re du kontrol nayên paşguhkirin. Yekem, oligomycinê bi kar bînin da diyar bikin ka çiqas ji senteza ATP ya pîvandî bi ATP sentazê ve girêdayî ye. Duyem, ceribandina vegerandina mîqdara zêdekirî di şertên bê şane de pêk bînin, bi ATP ya mîqdara wê tê zanîn, reagenta temam û heman konsantrasyonên boyaxê yên ku hatine bikaranîn; herî kêm 0, 100 nM, 300 nM, 1 uM û 2 uM. Boyax dikare ronahiya weşandî hilgire, enzîma raporker asteng bike an kîmyaya redoksê ya reagentê biguhezîne. Rêberiya giştî ya ceribandinên lûsîferazê ji bo bi rastî vê cureyê destwerdanê ceribandinên biyokîmyayî yên dij-kontrolê pêşniyar dike. Tenê ji ber ku vemirandina floresansê bi gelemperî di konsantrasyonên bilindtir de xirabtir e, texmîn nekin ku 1 uM ji artîfaktan azad e.

Sondên potansiyela membranê belavbûna boyaxê dipîvin, ne herikînê

Safranine O, TMRM û TMRE, rhodamine 123 û JC-1 hemû katyonên ku dikarin ji membranê derbas bibin in. Ew li gorî hevsengiya elektrokîmyayî di matrîksa bi barkirina neyînî de kom dibin, ji ber vê yekê floresansa tevahî potansiyelê bi awayekî nerasterast, li gorî cihê sondê, nîşan dide. Tu yek ji wan ATP an herikîna elektronan napîve.

Ji bo her sondê amadekariyeke guncawtir heye. Safranine O ji bo mîtokondriyên veqetandî û şaneyên derbasbar-kirî guncaw e; bi gelemperî bi konsantrasyona nêzî 2 uM, teşwîqa nêzî 495 nm û weşandina nêzî 585 nm tê bikaranîn. Ew di rejîma vemirandinê de dixebite, ku tê de hildana sondê floresansa tevahî diguhezîne. TMRM û TMRE ji bo şaneyên saxlem bi barkirina kêm a nanomolar di moda bê vemirandinê de guncaw in; tê de depolarîzasyon boyaxê berdide û floresansa mîtokondrî kêm dibe. Di barkirina bilind de, bi rêya xwe-vemirandinê arasteya sînyalê dikare berevajî bibe. JC-1 rêjeyeke hêsan a kesk li sor dide, lê bi barkirinê û masa mîtokondriyan ve girêdayî ye; ji ber vê yekê ji bo xebata kantîtatîf ji TMRM ya bi baldarî hatî kontrolkirin lawaztir e. Ev lihevkirinên di navbera sûd û sînordariyan de di nirxandineke berbelav a sondên potansiyela membrana mîtokondriyan de hatine kurtkirin.

Şîna metîlenê tam di konsantrasyonên xebatê de ji aliyê optîkî ve destwerdanê dike. Bandên wê yên hildana ronahiyê yên nêzî 600 heta 665 nm bi weşandina sor a sondan re li hev dikevin; ji ber vê yekê bandorên fîltra hundirîn, vemirandin û hildana ronahiya teşwîqê hemû ihtîmalên bawerbar in. Boyax herwiha katyoneke lîpofîlîk a duyem e ku belavbûna wê bi potansiyela ku tê pîvandin re diguhere. Parastina li hember vê yekê pîvandinên dubare bi rêbazên cihêreng û kontrolên vala ne: sond bi tenê, boyax bi tenê, sond bi her konsantrasyona boyaxê re, depolarîzasyona temam bi FCCP wekî referansa sifirê, û bi awayekî îdeal sondeke duyem a ji aliyê optîkî ve cuda. Lêkolîna rêya derbasî Komplekse III ev nimûne saz kir: piştî astengkirina bi antimycin û myxothiazolê, vegerandina potansiyela membranê bi safranine O û TMRM her duyan dubare kir û heman vegerandina kalîtatîf bi dest xist. Yek raporkerê optîk nîşaneyek e. Du raporkerên serbixwe delîl in.

Sê amadekarî, sê pirsên cuda

Mîtokondriyên veqetandî, şaneyên derbasbar-kirî û şaneyên saxlem ne mîhengên hestiyariya ku li ser heman ceribandinê dikarin şûna hev bigirin in. Ew têgehên cuda ne û prensîbên wan ên xebatê jî cuda ne.

Mîtokondriyên veqetandî zincîra veguhastina elektronan, membrana hundirîn û makîneya matrîksê diparêzin, lê membrana plazmayê, sîtozol û avahiya torê radikin. Armanc bi xwe ev rakirin e: substrat, ADP, astengker û konsantrasyonên boyaxê bi rastbûneke tam tên diyarkirin, ji ber vê yekê dikare rêyek bê destnîşankirin. Bedela wê windakirina dabînkirina xwezayî ya substratê, sînyaldan û daxwaza enerjiyê ye.

Şaneyên derbasbar-kirî mîtokondriyan di nav beşeke mezin a avahiya wan a şaneyî de dihêlin, lê dihêlin substratên ji derve û ADP ji membrana plazmayê ya vekirî derbas bibin. Ew amûra rast in ji bo destnîşankirina kêmasiyeke rêya substratê di çarçoveyeke şaneyî de. Derbasbar-kirina zêde zirarê dide membrana derveyî û rêkûpêkkirina sîtozolî bi şûştinê ji holê radibe.

Şaneyên saxlem her tiştî diparêzin: astenga membrana plazmayê, reduktekerên sîtozolî, veguhastina substratên hundirzayî, tora mîtokondriyan û daxwaza ATP. Ew herî nêzî fîzyolojiyê û herî dûrî mekanîzmayê ne, ji ber ku hildan, reduksîyon û girtina boyaxê di beşên şaneyê de hemû ekspozîsyona bandorker a mîtokondriyan diyar dikin.

Lêkolîna TEGDMA bi qest her sê ast bi kar anîn: mîtokondriyên veqetandî yên mêjî ji bo vegerandina oksîdasyonê û potansiyelê bi boyaxê, şaneyên kok ên pulpaya diranan ên derbasbar-kirî bi piranî ji bo diyarkirina ku cihê têkçûnê oksîdasyona substratê ya girêdayî Komplekse I ye, û şaneyên kok ên saxlem ji bo bandora net a fîzyolojîk a boyaxa 2 uM li ser vexwarina oksîjenê ya hatî tepisandin. Ji bo xwendevanên ku encamên mîtokondrî yên amadekariyên cuda didin ber hev, nivîsa raveker a hevalbend li ser ka şîna metîlenê çawa elektronan di zincîra bêhnvedanê de diguhezîne paşxaneya rêyê dide, û rêbera xwendina lêkolînên bêhnvedanê yên şîna metîlenê mantiqa mîqdarê û astengkeran vedigire.

Kontrolên ku boyaxeke çalak di redoksê de hewce dike

Madeyeke ku dikeve çerxa redoksê ji astengkereke asayî lîsteyeke dirêjtir a kontrolan hewce dike, ji ber ku kîmyaya boyaxê bi tenê dikare biyolojiyê teqlîd bike.

Ji bo respîrometriyê, odeyeke tenê bi buferê ji bo guhertina hêdî ya sînyalê, odeyeke bi bufer û boyaxê bê materyala biyolojîk, boyax bi her reduktekereke derveyî şaneyê ya di ceribandinê de heyî re, û di dawiyê de rotenone tevî antimycinê bi kar bînin da vexwarina oksîjenê ya ne-mîtokondrî di şaneyên saxlem de diyar bikin. Bal bidin ku boyaxa reduktebûyî bi veguhastina elektronan bo oksîjenê û çêkirina peroksîda hîdrojenê ji nû ve oksîde dibe. Ji ber vê yekê, kontrola vala ya tenê bi boyaxê bê elektron-donorekê vexwarina oksîjenê ya bê şane ku dema NADH an NADPH peyda dibe çêdibe, ji ya rast kêmtir nîşan dide.

Ji bo peroksîda hîdrojenê, Amplex UltraRed a kalîbrekirî tevî peroksîdaza horseradishê li şûna boyaxên DCFDA yên nehilbijartî tercîh bikin, bi katalazê piştrast bikin û girêdayîbûna bi ronahîdanê re biceribînin, ji ber ku boyax fotosensîtîzerek e. Lêkolîna mîtokondriyên mêjî dît ku tenê bi boyaxa 100 nM barê peroksîdê ji çar qatan zêdetir bû, dema ku rakirina wê hêdîtir bû; peroksîd rasterast ji boyaxa reduktebûyî çêbû, bê navbeynkara superoksîdê. Hûrguliyên hilbijartina sondê û kontrolên ronahiyê di nivîsa hevalbend li ser pîvandina cureyên reaktîf ên oksîjenê di ceribandinên boyaxê de de ne. Pirsa berfirehtir a ka peroksîd kengê wekî sînyal û kengê wekî bar tevdigere jî li gel hevsengiya redoksê ya şaneyî û îdiayên antîoksîdan tê şîrovekirin.

Ji bo îdiayên li ser rêyê, her du cihên astengker ên Komplekse III biceribînin: antimycin A li cihê Qi û myxothiazol li cihê Qo, tevî xala dawî ya Komplekse IV bi cyanide. Lêkolîneke berê ya mêjiyê mişkan ragihand ku boyaxê bêhnvedana bi rotenone hatî astengkirin vegerand, lê ya bi antimycin hatî astengkirin negerand. Lê lêkolîna paşîn a sê cureyên heywanan vegerandina qismî bi her du astengkeran û delîlên reduksîyona rasterast a cytochrome c dît. Rêya derbasî wekî ya ku bi daneyên nûtir re li hev tê binirxînin, ne wekî tişteke teqezbûyî; ji ber ku konsantrasyona boyaxê, cihê astengkerê, rewşa substratê û belavbûna boyaxê hemû rêya ku tê dîtin diguhezînin.

Matrîsa hilbijartina ceribandinê

Vê tabloyê bi kar bînin da li gorî pirsê pîvandinê hilbijêrin, ne berevajî.

Ji bo îdiayeke herî kêm qanîker, divê heman konsantrasyonên boyaxê, 100 nM, 300 nM, 1 uM û 2 uM, di van pîvandinan de bên bikaranîn: herikîna oksîjenê di şertên rûniştinê, ADP, oligomycin û madeya jihev-veqetîner de; leza senteza ATP; potansiyela membranê bi tercîhê bi du sondan; û berdana peroksîdê ya kalîbrekirî bi katalazê û kontrolên bê şane. Koma bi hev ve girêdayî ragihînin: herikîna oksîjenê tevî leza ATP, ATP ji bo her oksîjenê, potansiyel û peroksîd. Her yek ji wan hejmaran bi tenê pîvandinek e ku li wateyekê digere.