메틸렌 블루와 바르토넬라: 실험실 연구 결과와 임상 근거의 한계

배양 접시와 환자에게는 ‘감염’이라는 같은 단어가 쓰이지만, 그 개념은 다릅니다. 접시에서 감염은 한천 배지 위 집락의 수로 나타납니다. 환자에게서는 세포와 혈관 안의 세균, 혈액과 조직을 이동하는 약물, 그리고 방어 작용의 일부를 담당하는 면역계가 함께 관여합니다. 이 둘을 혼동하면 인상적인 실험실 수치가 치료법처럼 보이기 시작합니다. 둘을 구분하면 같은 수치는 본래의 의미를 갖게 됩니다. 바로 다음 실험을 수행할 이유입니다.

메틸렌 블루와 바르토넬라를 다루는 이 검토의 핵심은 이러한 구분입니다. 한 연구진이 수행한 두 실험실 연구는 증식하지 않는 상태의 Bartonella henselae를 대상으로 메틸렌 블루를 시험했습니다. 두 연구 모두 유리와 플라스틱 실험 용기 안에서 강한 활성을 보고했습니다. 어느 연구도 사람을 대상으로 시험하지는 않았습니다.

연구자들이 정지기를 시험하는 이유

대부분의 항생제 시험은 증식 중인 세포를 사용합니다. 이 모델은 더 까다로운 경우를 놓칩니다. 분열을 멈추고, 증식 중인 같은 세균을 죽이는 약물에도 견디는 세포입니다.

바르토넬라는 적혈구와 내피세포 내부를 포함해 체내에 지속적으로 존재할 수 있습니다. 따라서 연구진은 B. henselae가 정지기에 들어간 뒤 어떤 승인된 약물이 이를 사멸시킬 수 있는지 조사했습니다. 증식 중인 세포에 대한 낮은 MIC는 정지기 세포의 사멸을 예측하지 못했습니다. 리팜핀은 MIC가 매우 낮았지만 정지기 세포를 잘 사멸시키지 못한 반면, MIC 값이 더 높은 화합물들은 이 세포들을 잘 사멸시켰습니다. 이런 유형의 논문을 읽는 일반적인 방법을 알고 싶은 독자는 메틸렌 블루 연구 읽기 안내에서 확인할 수 있습니다.

첫 선별 시험: Li 연구진, 2019

Antibiotics에 발표된 2019년 정지기 선별 시험은 단일 균주인 B. henselae JK53을 사용했으며, 10 percent의 태아 소 혈청을 첨가한 Schneider 배지에서 37 C, 5 percent CO2 조건으로 배양했습니다. 하루 동안 배양한 시료에는 대부분 분산된 상태로 분열하는 세포가 있었습니다. 5일 배양 시료는 mL당 약 10의 8승 집락 형성 단위에 이르렀으며, 정지기로 간주되었고 눈에 보이는 응집체를 포함했습니다.

분석에는 SYBR Green I과 프로피듐 아이오다이드를 사용했으며, 살아 있는 세포와 이소프로판올로 사멸시킨 세포의 혼합물을 기준으로 보정했습니다. 메틸렌 블루는 색이 강하기 때문에, 선별된 후보의 결과를 현미경으로 확인한 뒤 더 엄격한 평가 지표인 혈액 한천 배지의 집락 수로 다시 확인했습니다.

승인된 약물 1,581종을 50 micromolar에서 시험한 결과, 메틸렌 블루 처리 후 생존율은 플레이트 리더 측정에서 16 percent, 현미경 관찰에서 25 percent였습니다. 답토마이신은 21 percent, 여러 아졸계 약물은 22~27 percent, 겐타마이신은 32 percent, 에리트로마이신은 66 percent, 시프로플록사신은 74 percent였습니다. 피르비늄 파모에이트는 플레이트 리더에서 더 강한 활성을 보이는 듯했지만, 자체 형광 때문에 현미경으로는 평가할 수 없었습니다.

증식 중인 B. henselae에 대한 메틸렌 블루의 MIC는 0.08~0.16 micrograms per mL였습니다. 5일 배양한 정지기 세포에 5 micrograms per mL를 적용했을 때, 노출 하루 후에는 검출 가능한 집락이 없어졌습니다. 이는 각각의 시험 농도에서 답토마이신과 피르비늄 파모에이트가 보인 결과와 같았습니다. 별도의 시간별 사멸 시험에서는 10 micrograms per mL를 사용했습니다. 이는 투여량이 아니라 실험실 노출 농도이며, 논문도 그렇게 명시합니다. 논문에서 인용한 약 3.9 micrograms per mL의 사람 최고 혈장 농도는 배경 정보로만 제시되어 있습니다. 메틸렌 블루 약동학 개요에서는 혈장 수치를 조직 수치로 해석할 수 없는 이유를 설명합니다.

논문은 두 가지 한계를 명시합니다. 생물막 모델이 없었고, 메틸렌 블루 병용 시험도 없었습니다. 5일 배양 시료의 응집체는 정지기 액체 배양에서 형성된 세포 덩어리이지, 검증된 생물막 실험이 아니었습니다. 저자들은 동물 연구, 병용 연구, 생물막 연구, 그리고 다른 바르토넬라 종에 대한 시험이 필요하다고 밝혔습니다.

병용 조합과 생물막 유래 세포: Zheng 연구진, 2020

BMC Microbiology에 발표된 2020년 후속 연구는 같은 균주와 배지를 유지했지만, 6일 배양한 정지기 시료를 사용했습니다. 또한 첫 논문에 없었던 두 가지, 즉 두 약물의 병용 조합과 생물막 유래 세포 모델을 추가했습니다.

각 단일 약물을 동일한 5 micrograms per mL 농도로 24시간 처리했을 때, 메틸렌 블루 처리군에는 mL당 3.2 곱하기 10의 4승 집락 형성 단위가 남았으며, 대조군은 약 2.8 곱하기 10의 10승이었습니다. 같은 시점에 시프로플록사신, 겐타마이신, 니트로푸란토인 처리군에는 더 적은 집락이 남았습니다. 이는 동일한 명목 농도에서 하루 후 검출 가능한 집락이 없었던 2019년 결과와 다릅니다. 배양 기간, 밀도, 취급 방식이 달랐으므로 사멸 효과의 방향은 재현되었지만 그 크기는 같지 않았습니다. 이러한 실험 간 변동은 일반적인 안전성 및 상호작용 검토에서 실험실의 사멸 활성을 임상 효과와 구분하는 이유 중 하나입니다.

병용 선별 시험은 가장 많이 인용되는 부분입니다. 모든 구성 약물의 농도는 5 micrograms per mL로 고정했습니다. 아지트로마이신과 메틸렌 블루, 리팜핀과 메틸렌 블루의 두 조합 모두 24시간 후 검출 가능한 정지기 집락이 없었습니다. 시프로플록사신을 포함한 두 조합도 같은 결과를 보였으며, 시험한 25개 조합 중 이 네 조합만 이러한 결과를 보였습니다. 정식 상승작용 분석은 수행하지 않았으므로, 올바른 표현은 ‘이 조건에서 활성을 보인 병용 조합’이지 ‘입증된 상승작용’이 아닙니다.

생물막 실험은 형성된 지 얼마 되지 않은 생물막을 파괴한 뒤 회수한 세포를 시험한 것이며, 온전한 성숙 생물막 내부로의 침투를 시험한 것이 아닙니다. 배양물을 5일간 키운 뒤 희석해 웰 플레이트에서 5일 더 배양하고, 크리스털 바이올렛 염색으로 확인한 다음 약물에 노출하기 전에 긁어냈습니다. 5 micrograms per mL에서 메틸렌 블루 단독 처리군의 집락 형성 단위는 6일째에 2.3 곱하기 10의 2승까지 감소했습니다. 단일 약물 중 가장 좋은 결과에 속했지만 0은 아니었습니다. 메틸렌 블루를 포함한 두 병용 조합은 모두 6일째에 0에 도달했고, 시프로플록사신을 포함한 두 조합도 마찬가지였습니다.

저자들은 신중한 독자라면 짚을 만한 한계를 그대로 제시했습니다. 오래되고 온전한 생물막이 아니라 형성된 지 얼마 되지 않아 긁어낸 생물막을 사용했고, 각 약물의 현실적인 최고 농도 대신 모든 약물에 하나의 편의상 정한 농도를 적용했습니다. 아지트로마이신이나 리팜핀을 중심으로 선택한 일부 조합만 시험했으며, 균주는 하나뿐이었고 동물도 환자도 포함하지 않았습니다. 이후 세 약물 병용 연구가 제안되었지만, 결과가 보고된 것은 아닙니다.

연구 설계 비교

이 표는 이 글의 요점을 압축해서 보여 줍니다. 마지막 열 왼쪽의 모든 내용은 배양 실험입니다. 두 논문의 어떤 결과도 마지막 열에 해당하지 않습니다.

바르토넬라는 보렐리아가 아닙니다

두 논문 모두 라임병을 일으키는 스피로헤타인 Borrelia burgdorferi를 언급합니다. 염색 분석법이 같은 실험실에서 앞서 수행한 보렐리아 정지기 연구에서 비롯되었기 때문입니다. 그 연구에서도 메틸렌 블루와 답토마이신이 활성 후보로 선별되었습니다. 이러한 연구 이력은 유용한 배경이면서 흔한 오류의 원인이기도 합니다.

두 바르토넬라 논문 중 어느 실험도 보렐리아와 바르토넬라를 나란히 비교 시험하지 않았습니다. 균종, 배지, 농도가 서로 다르며, 바르토넬라에서 메틸렌 블루가 막에 영향을 미친다는 가설은 추가 연구가 필요한 추정으로 제시되었습니다. 결과를 다른 종에 그대로 적용해서는 안 되며, 어느 논문도 기생충에 대한 포괄적인 주장을 뒷받침하지 않습니다. 보렐리아와 바르토넬라의 지속 생존 세포 비교에서는 이러한 이유로 두 연구 문헌을 구분합니다.

배양 결과가 치료 프로토콜이 될 수 없는 이유

메틸렌 블루 바르토넬라 치료 프로토콜에 대한 검색 관심은 이해할 만합니다. 그러나 이 논문들은 그 문구를 구매 목록이 아니라 경고 신호로 받아들여야 하는 이유를 보여 줍니다.

첫째, 웰 안의 5 micrograms per mL는 처방이 아닙니다. 이 수치에는 흡수, 분포, 단백질 결합, 세포 내 침투 또는 내약성에 관한 정보가 연결되어 있지 않습니다. 저자들은 항생제 최고 농도의 대략적인 평균으로 이 값을 선택했으며, 향후 연구에서는 각 약물의 현실적인 농도를 사용해야 한다고 밝혔습니다.

둘째, 집락이 0이라는 것은 해당 평판 배양 조건에서 집락이 없다는 뜻이지, 조직에 세균이 없다는 뜻이 아닙니다. 지속 생존 세포, 세포 내 세균, 시료 채취의 한계는 모두 한천 배지가 포착하지 못하는 영역에 있습니다.

셋째, 웰 안에서 세균을 완전히 제거하는 조합도 체내에서는 실패하거나 해를 끼칠 수 있습니다. 아지트로마이신과 메틸렌 블루, 리팜핀과 메틸렌 블루는 실험실 노출 조건에서 시험한 조합입니다. 동물 약동학 자료와 대조군을 둔 사람 대상 연구 자료가 없으면 용량, 기간, 이익 대비 위험 비율을 제시할 수 없습니다. 선택지를 검토하는 사람은 배양 접시 자료에서 어떤 결론을 내리기 전에 의료진과 상의하고, 메틸렌 블루 사용에 의료적 감독이 필요한 경우를 확인해야 합니다.

이 논문들이 뒷받침하는 제한적인 결론은 다음과 같습니다. 메틸렌 블루는 두 약물의 실험실 병용 조합을 포함해, 시험관 내에서 증식하지 않는 B. henselae JK53에 대해 재현 가능한 활성을 보입니다. 병용 조합과 생물막 유래 세포에서 가장 강한 결과는 2020년 연구에서 나왔습니다. 이 활성이 사람의 바르토넬라증에 의미가 있는지를 비롯한 나머지 사항은 모두 아직 시험되지 않았습니다.