មេទីឡែនប្លូសម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌ DNA និង RNA៖ ការប្រើប្រាស់លើជែល និងភ្នាស

និស្សិតម្នាក់ធ្វើអេឡិចត្រូផូរ៉េសលើជែលអាហ្គារ៉ូស ជ្រលក់វាដោយមេទីឡែនប្លូ ហើយមិនឃើញអ្វីនៅកន្លែងដែលគេរំពឹងថានឹងមានបន្ទាត់ភ្លឺច្បាស់។ នៅកន្លែងធ្វើការក្បែរនោះ អ្នកស្រាវជ្រាវក្រោយបណ្ឌិតម្នាក់ជ្រលក់ភ្នាស Northern ដោយប្រើដបសារធាតុពណ៌ខៀវដូចគ្នា ហើយទទួលបានបន្ទាត់រីបូសូមច្បាស់ៗក្នុងរយៈពេលបីនាទី។ និស្សិតនោះសន្និដ្ឋានថាការធ្វើជែលបរាជ័យ។ ប៉ុន្តែការធ្វើជែលមិនបានបរាជ័យទេ។ កិច្ចការទាំងពីរខុសគ្នា ហើយសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដូចគ្នានេះឆ្លើយតបនឹងកិច្ចការទាំងនោះដោយមានភាពរសើប ពណ៌ផ្ទៃខាងក្រោយ និងវិធានសម្រាប់ជំហានបន្ទាប់ខុសៗគ្នា។

ការជ្រលក់ពណ៌ DNA និងការជ្រលក់ពណ៌ RNA ដោយមេទីឡែនប្លូមានគីមីវិទ្យាដូចគ្នា ប៉ុន្តែមានគោលបំណងខុសគ្នា។ ក្នុងជែល សារធាតុជ្រលក់ពណ៌បង្ហាញថាមានអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកប៉ុន្មាននៅក្នុងម៉ាទ្រីសដែលមានរន្ធតូចៗ។ លើភ្នាស វាបង្ហាញថាតើការផ្ទេរបានជោគជ័យឬអត់ និងថាតើគន្លងនីមួយៗត្រូវបានដាក់សំណាកស្មើគ្នាឬអត់។ នៅពេលយល់ច្បាស់ពីភាពខុសគ្នានេះ ពិធីការ កម្រិតកំណត់នៃការរកឃើញ និងកម្រិតកំណត់នៃភាពឆបគ្នាក៏កាន់តែងាយយល់។

ចម្លើយខ្លី

មេទីឡែនប្លូជាសារធាតុជ្រលក់ពណ៌កាត្យុងដែលមានរចនាសម្ព័ន្ធរាប ហើយភ្ជាប់នឹងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកដោយមិនបង្កើតសម្ព័ន្ធកូវ៉ាឡង់ និងអាចបញ្ច្រាសបាន។ ការភ្ជាប់នេះកើតឡើងតាមរយៈការរួមបញ្ចូលគ្នានៃកម្លាំងទាក់ទាញអេឡិចត្រូស្តាទិចទៅកាន់ផូស្វាត ការស៊កចូលរវាងគូបាស និងការភ្ជាប់នៅចង្អូរតូច។ សមត្ថភាពបញ្ច្រាសនេះហើយជាចំណុចសំខាន់។ បន្ទាត់អាចត្រូវបានជ្រលក់ពណ៌ មើលក្រោមពន្លឺដែលមើលឃើញ ថតទុក ហើយបន្ទាប់មកលាងជម្រះពណ៌ ឬបន្សុទ្ធសម្រាប់ការធ្វើក្លូន ហាយប្រ៊ីដកម្ម ឬការប្រើប្រូបឡើងវិញ។

សម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌ DNA ខ្សែទ្វេក្នុងជែលអាហ្គារ៉ូសដោយមេទីឡែនប្លូ រូបមន្តរហ័សស្តង់ដារគឺ 0.02 percent w/v (200 micrograms ក្នុងមួយ mL) ក្នុងទឹក ជ្រលក់ប្រហែល 15 minutes រួចលាងជម្រះពណ៌ដោយទឹកប្រហែល 15 minutes ហើយមើលលើប្រអប់ពន្លឺស។ សម្រាប់ភ្នាស រូបមន្ត Northern blot បុរាណគឺសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ 0.02 ដល់ 0.04 percent ក្នុងសូដ្យូមអាសេតាតនៅជិត pH 5.2 ជ្រលក់រយៈពេលប៉ុន្មាននាទីក្រោយការផ្ទេរ និងការចងសំណាកឱ្យជាប់ រួចលាងដោយទឹក និងលាងជម្រះពណ៌ទាំងស្រុងមុនធ្វើហាយប្រ៊ីដកម្ម។ ភាពរសើបមានកម្រិតមធ្យម៖ ពីរាប់សិបទៅរាប់រយណាណូក្រាមក្នុងមួយបន្ទាត់ជែលក្រោមលក្ខខណ្ឌល្អ ហើយមគ្គុទ្ទេសក៍ដែលប៉ាន់ប្រមាណបែបប្រុងប្រយ័ត្នរាយកម្រិត 0.5 ដល់ 1 microgram។ កម្រិតនេះខ្ពស់ជាងកម្រិតរកឃើញរបស់អេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍ និងសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ SYBR ជាច្រើនលំដាប់ទំហំ។ លើភ្នាស មិនមានកម្រិតរកឃើញតែមួយសម្រាប់ត្រានស្គ្រីបជាក់លាក់ដែលមានប្រយោជន៍នោះទេ ព្រោះសារធាតុជ្រលក់ពណ៌បង្ហាញជាចម្បងនូវ RNA រីបូសូមដែលមានច្រើន និងសារធាតុសរុបដែលបានដាក់។ កុំយកសូលុយស្យុងអាហារបំប៉នដែលលក់រាយមកជំនួសក្នុងរូបមន្តណាមួយនេះ។ វិធីសាស្ត្រដែលបានផ្ទៀងផ្ទាត់សន្មតថាប្រើសារធាតុជ្រលក់ពណ៌កម្រិតវិភាគ ប៊ូហ្វ័រដែលមានសមាសភាពកំណត់ច្បាស់ និងការចាត់ចែងដែលគ្មាន RNase នៅពេលធ្វើការជាមួយ RNA។

របៀបដែលការភ្ជាប់ដំណើរការ និងចំណុចដែលអាចនាំឱ្យយល់ខុស

គំរូដែលមានប្រយោជន៍នេះមានបីផ្នែក។ ទីមួយ ប្រព័ន្ធរង្វង់ដែលមានបន្ទុកវិជ្ជមានត្រូវបានទាក់ទាញទៅកាន់គ្រោងផូស្វាតដែលមានបន្ទុកអវិជ្ជមាន។ ការសិក្សាស្ប៉ិចត្រូស្កូពីរកឃើញថាសមាសភាគអេឡិចត្រូស្តាទិចនេះមានឥទ្ធិពលចម្បងនៅកំហាប់អំបិលទាប ខណៈការធ្វើគំរូ និងឌីណាមិកម៉ូលេគុលបង្ហាញថាការស៊កចូលរវាងគូបាស និងការភ្ជាប់នៅចង្អូរតូចជារបៀបភ្ជាប់ដែលមានស្ថិរភាពសម្រាប់ DNA ខ្សែទ្វេ ដូចដែលបានសង្ខេបក្នុងការសិក្សាស្ប៉ិចត្រូស្កូពីអំពីការភ្ជាប់មេទីឡែនប្លូទៅនឹង DNA។ ទីពីរ មានទំនោរភ្ជាប់ទៅនឹង GC មួយកម្រិត ដោយការធ្វើគំរូបង្ហាញទំនោរទៅកាន់ជំហាន CpG និង GpC ហើយការពិសោធន៍រាយការណ៍ថាវាភ្ជាប់ជាទីពេញចិត្តទៅនឹងខ្សែទ្វេដែលសម្បូរ GC ក្នុងការសិក្សាអំពីទំនោរនៃការស៊កចូលរបស់មេទីឡែនប្លូ ប៉ុន្តែវាក៏ភ្ជាប់ទៅនឹងខ្សែទ្វេ AT ដែរ។ ការជ្រលក់ពណ៌ជាប្រចាំមិនមានភាពជាក់លាក់ចំពោះលំដាប់បាសទេ។ ទីបី DNA ខ្សែតែមួយ និង RNA ភ្ជាប់ជាចម្បងតាមរយៈកម្លាំងអេឡិចត្រូស្តាទិច និងការតម្រៀបជាជង់ជាមួយបាសដែលអាចចូលដល់ និងតំបន់ខ្សែទ្វេ។ ហេតុនេះហើយបានជាកម្រិតពណ៌ប្រែប្រួលតាមប្រវែង លំដាប់បាស និងរចនាសម្ព័ន្ធបន្ទាប់បន្សំ។

មានផលវិបាកពីរដែលកើតតាម។ ដោយសារការភ្ជាប់មិនមែនជាសម្ព័ន្ធកូវ៉ាឡង់ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌អាចត្រូវបានលាងចេញ។ បន្ទាត់ក្នុងប៉ូលីអាគ្រីឡាមីតស្រកពណ៌យ៉ាងឆាប់រហ័ស លុះត្រាតែមានការចងឱ្យជាប់ដោយចេតនា។ មានវិធីកែប្រែសម្រាប់ការចងពណ៌ឱ្យជាប់ជាអចិន្ត្រៃយ៍ដោយឡែក ព្រោះការជ្រលក់ពណ៌ធម្មតាមានលក្ខណៈបណ្តោះអាសន្ន ដូចដែលបានពណ៌នាដោយ Soto និង Draper សម្រាប់ជែល PAGE។ ដោយសារសារធាតុជ្រលក់ពណ៌នេះជាសារធាតុជំរុញប្រតិកម្មដោយពន្លឺ ការបំភ្លឺ DNA ដែលបានជ្រលក់ពណ៌ដោយពន្លឺខ្លាំងរយៈពេលយូរ នៅពេលមានអុកស៊ីសែន អាចធ្វើអុកស៊ីតកម្មលើហ្គួនីន ហើយនៅទីបំផុតបង្កស្នាមដាច់លើខ្សែ។ យន្តការនេះត្រូវបានពន្យល់លម្អិតក្នុងការសិក្សាអំពីអុកស៊ីតកម្មហ្គួនីនដែលជំរុញដោយមេទីឡែនប្លូ។ ការមើលក្រោមពន្លឺសរយៈពេលខ្លីជៀសវាងការខូចខាតដោយ UV ដែលគេស្គាល់ច្បាស់ក្នុងលំហូរការងារអេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍បុរាណ ហើយអត្ថប្រយោជន៍នេះមានពិតសម្រាប់ការស្រង់យក DNA ទៅប្រើបន្ត។ ពន្លឺដែលមើលឃើញមានឥទ្ធិពលទន់ជាង ប៉ុន្តែមិនមែនគ្មានការប៉ះពាល់ទេ។ រក្សាពេលបំភ្លឺឱ្យខ្លី នៅពេល DNA នឹងត្រូវយកទៅធ្វើក្លូន។ សម្រាប់គីមីវិទ្យាពន្លឺទូលំទូលាយដែលជាមូលដ្ឋាននៃការប្រុងប្រយ័ត្ននេះ សូមមើលផ្លូវប្រតិកម្មពីរក្នុងគីមីវិទ្យាពន្លឺរបស់មេទីឡែនប្លូ។ សម្រាប់គូរេដុក និងស្ថានភាពបន្ទុកដែលពន្យល់ថាហេតុអ្វីទម្រង់អុកស៊ីតកម្មភ្ជាប់បាន ខណៈទម្រង់រេដុកម្មមិនភ្ជាប់ សូមមើលគីមីវិទ្យានៃរចនាសម្ព័ន្ធ និងលក្ខណៈសម្បត្តិរបស់មេទីឡែនប្លូ។

កិច្ចការទីមួយ៖ ការជ្រលក់ពណ៌ក្នុងជែល

ការជ្រលក់ពណ៌ជែលឆ្លើយសំណួរមួយ៖ តើក្នុងបន្ទាត់នេះមានអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីកគ្រប់គ្រាន់ឱ្យមើលឃើញដោយភ្នែកឬអត់។ DNA ខ្សែទ្វេក្នុងអាហ្គារ៉ូសជាករណីដែលត្រូវបានសិក្សាកំណត់លក្ខណៈច្បាស់ជាងគេ។ វិធីសាស្ត្រជែលមេទីឡែនប្លូដើមរបស់ Flores និងសហការី បានផ្ទៀងផ្ទាត់ពិធីការរហ័ស 0.02 percent លើអាហ្គារ៉ូស 1 percent ហើយបង្ហាញថាអាចស្រង់យក និងធ្វើក្លូនបានជោគជ័យក្រោយមក។ ពិធីការដូចគ្នារបស់អ្នកផ្គត់ផ្គង់មាននៅលើទំព័រផលិតផលមេទីឡែនប្លូរបស់ IBI Scientific ដែលរាយរូបមន្តសម្រាប់ភ្នាស 0.04 percent និងវិធីកែប្រែរហ័សសម្រាប់ជែលទន្ទឹមគ្នា។

លំហូរការងារជាក់ស្តែង៖

1. ធ្វើអេឡិចត្រូផូរ៉េសជែលដូចធម្មតា។ ជ្រលក់ពណ៌ក្រោយអេឡិចត្រូផូរ៉េស មិនមែនក្នុងអំឡុងពេលដំណើរការនោះទេ លុះត្រាតែការផ្ទេរ ឬសមត្ថភាពបំបែកត្រូវបានផ្ទៀងផ្ទាត់សម្រាប់វិធីសាស្ត្រដែលបានកែប្រែ។
2. ជ្រមុជក្នុងមេទីឡែនប្លូ 0.02 percent w/v ក្នុងទឹកចម្រាញ់ ដោយអង្រួនថ្នមៗ ប្រហែល 15 minutes។
3. លាងជម្រះពណ៌ដោយប្តូរទឹកជាច្រើនដង សរុបប្រហែល 15 minutes រហូតដល់ពណ៌ផ្ទៃខាងក្រោយនៃម៉ាទ្រីសថយចុះ ហើយបន្ទាត់លេចច្បាស់។
4. ថតរូបភ្លាមៗលើឧបករណ៍បំភ្លឺពន្លឺស។

អាហ្គារ៉ូស និងប៉ូលីអាគ្រីឡាមីតមានឥរិយាបថខុសគ្នា។ អាហ្គារ៉ូសរក្សាសារធាតុជ្រលក់ពណ៌នៅក្នុងម៉ាទ្រីស ដូច្នេះការលាងជម្រះពណ៌ជាជំហានដែលយឺត។ ជែលប៉ូលីអាគ្រីឡាមីតស្តើងជ្រលក់ពណ៌បានលឿន ប៉ុន្តែក៏បាត់ពណ៌លឿនដែរ។ នេះជួយដល់ការកាត់យកសំណាកទៅប្រើបន្ត ប៉ុន្តែធ្វើឱ្យពិបាករក្សាកំណត់ត្រារយៈពេលវែង។ អូលីហ្គូនុយក្លេអូទីតសំយោគក្នុងប៉ូលីអាគ្រីឡាមីតអាចត្រូវបានកំណត់ទីតាំងដោយរូបមន្ត 0.02 percent ដូចគ្នា ក្នុងរយៈពេល 20 ដល់ 30 minutes ដោយលាងទឹកម្តងហើយម្តងទៀត តាមវិធី PAGE ដែលបានបង្កើតឡើងក្នុងរបៀបរបស់ Current Protocols។ មានរបាយការណ៍អំពីវិធីកែប្រែដែលរាវខ្លាំង ប្រហែល 0.0002 percent ក្នុង TBE រាវ សម្រាប់អូលីហ្គូដែលត្រូវស្រង់យកទៅប្រើបន្ត ដោយចំណាយពេលច្រើនម៉ោង ប៉ុន្តែមូលដ្ឋានភស្តុតាងមានភាពរឹងមាំតិចជាង។

ភាពខុសគ្នារវាង DNA និង RNA មានសារៈសំខាន់។ DNA ខ្សែទ្វេផ្តល់ការភ្ជាប់តាមរចនាសម្ព័ន្ធខ្លាំងជាងគេ។ RNA និង DNA ខ្សែតែមួយអាចជ្រលក់ពណ៌បាន ប៉ុន្តែខ្សោយជាង និងពិបាកព្យាករជាង។ សម្រាប់ជែល RNA អាហ្គារ៉ូសដែលមានហ្វ័រម៉ាល់ដេអ៊ីត មន្ទីរពិសោធន៍ភាគច្រើនរំលងការជ្រលក់ពណ៌ខៀវក្នុងជែល ហើយផ្ទេរ RNA ទៅលើភ្នាសជាមុន រួចទើបជ្រលក់ពណ៌នៅទីនោះ។ ការផ្លាស់ប្តូរនេះជំនួសសញ្ញាខ្សោយក្នុងជែលដោយសញ្ញាច្បាស់ជាងលើភ្នាស ព្រមទាំងផ្តល់កំណត់ត្រានៃការដាក់សំណាក។

កិច្ចការទីពីរ៖ ការជ្រលក់ពណ៌លើភ្នាស

ការជ្រលក់ពណ៌លើភ្នាសឆ្លើយសំណួរផ្សេង៖ តើការផ្ទេរបានជោគជ័យឬអត់ ហើយតើគន្លងនានាអាចប្រៀបធៀបគ្នាបានឬអត់។ ការប្រើប្រាស់បុរាណគឺការជ្រលក់ពណ៌ Northern blot ដែលអាចបញ្ច្រាសបានរបស់ Herrin និង Schmidt។ រូបមន្តដើមគឺសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ 0.04 percent ក្នុងសូដ្យូមអាសេតាត 50 mM នៅ pH 5.0 រយៈពេល 2 ដល់ 3 minutes រួចលាងដោយទឹក ហើយអាចលាងចេញដោយ SDS រាវក្នុង SSPE មុនធ្វើហាយប្រ៊ីដកម្ម។

វិធីកែប្រែទំនើបដែលប្រើប្រាស់យ៉ាងទូលំទូលាយមានជំហានដូចខាងក្រោម៖

1. ផ្ទេរ RNA ឬ DNA ដែលបានបំបែកខ្សែទៅលើនីឡុង ឬនីត្រូសែលុយឡូស រួចចងឱ្យជាប់ដោយបង្កើតសម្ព័ន្ធឆ្លងដោយ UV ឬដោយកម្តៅ ដើម្បីកុំឱ្យសំណាកបាត់បង់ក្នុងពេលជ្រលក់ពណ៌។
2. ជំហានមិនចាំបាច់ ប៉ុន្តែប្រើញឹកញាប់៖ ធ្វើឱ្យភ្នាសសើមក្នុងអាស៊ីតអាសេទិក 5 percent ប្រហែល 15 minutes។
3. ជ្រលក់រយៈពេល 5 ដល់ 10 minutes ក្នុងមេទីឡែនប្លូ 0.02 ដល់ 0.04 percent ក្នុងសូដ្យូមអាសេតាត 0.3 ដល់ 0.5 M នៅជិត pH 5.2។
4. លាង និងលាងជម្រះពណ៌ក្នុងទឹករយៈពេល 5 ដល់ 15 minutes កត់ត្រាលទ្ធផល រួចយកសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដែលនៅសល់ចេញមុនធ្វើហាយប្រ៊ីដកម្ម។

នីឡុងដែលមានបន្ទុកវិជ្ជមានត្រូវបានប្រើជាចម្បងក្នុងការងារ Northern។ នីត្រូសែលុយឡូសក៏អាចប្រើបានជាមួយលំហូរការងារអាស៊ីតអាសេទិកបូកអាសេតាតដូចគ្នា។ រូបភាពត្រូវបានប្រើដើម្បីបញ្ជាក់ការផ្ទេរ ប្រៀបធៀបបន្ទាត់ 28S និង 18S (ឬ 23S និង 16S សម្រាប់ RNA បាក់តេរី) សម្គាល់ជណ្ដើរស្តង់ដារទំហំ និងស្តង់ដារផ្សេងៗ ហើយរក្សាកំណត់ត្រាប្រហាក់ប្រហែលសម្រាប់ការធ្វើសម្របតម្លៃតាម RNA សរុប។ វិធីសាស្ត្រ Northern ដែលបានបោះពុម្ពផ្សាយវាស់បរិមាណបន្ទាត់រីបូសូមដែលបានជ្រលក់ពណ៌សម្រាប់ពិនិត្យការដាក់សំណាក រួមទាំងការងារវិទ្យាសាស្ត្រផលិតផលទឹកដោះគោដែលបានប្រើបន្ទាត់រីបូសូមជ្រលក់ដោយមេទីឡែនប្លូសម្រាប់ការធ្វើសម្របតម្លៃ។ ភ្នាស Southern អាចត្រូវបានមើលឃើញតាមវិធីដូចគ្នា ប៉ុន្តែសារធាតុជ្រលក់ពណ៌នេះមានការប្រើប្រាស់ដែលបានបង្កើតមូលដ្ឋានច្បាស់លាស់ជាងច្រើនសម្រាប់ពិនិត្យការដាក់សំណាក និងការផ្ទេរក្នុង Northern។ ម្យ៉ាងទៀត DNA សម្រាប់ Southern ត្រូវបានបំបែកខ្សែមុនផ្ទេរ ដូច្នេះតួលេខភាពរសើបក្នុងជែលមិនអាចយកមកអនុវត្តដោយផ្ទាល់បានទេ។

កម្រិតរកឃើញ និងពណ៌ផ្ទៃខាងក្រោយ៖ ចំណុចដែលពណ៌ខៀវចាញ់

ការប្រៀបធៀបខាងក្រោមត្រូវបានរៀបចំឱ្យមានលក្ខណៈប្រហាក់ប្រហែលដោយចេតនា។ ប្រសិទ្ធភាពរបស់សារធាតុជ្រលក់ពណ៌អាស្រ័យលើភាគរយជែល ទទឹងបន្ទាត់ ប្រព័ន្ធអុបទិក និងភាពម៉ត់ចត់ក្នុងការលាងជម្រះពណ៌។ ចាត់ទុកតួលេខនីមួយៗជាការប៉ាន់ប្រមាណលំដាប់ទំហំ មិនមែនជាលក្ខណៈបច្ចេកទេសកំណត់ជាក់លាក់ទេ។

ការគ្រប់គ្រងពណ៌ផ្ទៃខាងក្រោយកំណត់ថាតើសញ្ញាដែលមានកម្រិតមធ្យមនេះអាចប្រើបានឬអត់។ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌សេរីមានពណ៌ខ្លាំង ដូច្នេះភាពផ្ទុយគ្នានៃពណ៌កើតឡើងពីការយកសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដែលមិនបានភ្ជាប់ចេញ ដោយមិនយកសារធាតុដែលបានភ្ជាប់ចេញផង។ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដែលមានកំហាប់ខ្ពស់ជាងកម្របង្កើនភាពរសើបណាស់។ វាបង្កើនជាចម្បងនូវពេលវេលាលាងជម្រះពណ៌។ សាកល្បងសំណាកជាស៊េរីពង្រាវលើជែល ភ្នាស និងកាមេរ៉ាដែលនឹងប្រើពិតប្រាកដ ហើយប្រើតែជួរដែលដង់ស៊ីតេអាំងតេក្រាលនៅតែសមាមាត្រនឹងបរិមាណសំណាកបញ្ចូល។ មេទីឡែនប្លូគាំទ្រការធ្វើសម្របតម្លៃនៃការដាក់សំណាកបែបពាក់កណ្តាលបរិមាណ។ វាមិនមែនជាការវិភាគបរិមាណដែលមានជួរឌីណាមិកធំទេ ព្រោះសមត្ថភាពរបស់ភ្នាស ប្រសិទ្ធភាពផ្ទេរ ភាពឆ្អែត និងការលាងជម្រះពណ៌ប្រែប្រួលពីគន្លងមួយទៅគន្លងមួយ។

កម្រិតកំណត់នៃភាពឆបគ្នា៖ អ្វីដែលនៅតែអាចប្រើបានក្រោយជ្រលក់ពណ៌

ការធ្វើក្លូនក្រោយជ្រលក់ពណ៌ខៀវត្រូវបានបង្ហាញថាអាចធ្វើបាន។ Flores និងសហការីបានកាត់យកបន្ទាត់អាហ្គារ៉ូសដែលជ្រលក់ពណ៌ ស្រង់យក DNA រួចភ្ជាប់បំណែក និងបញ្ចូលវាទៅក្នុងកោសិកា ដោយរាយការណ៍ថាការធ្វើក្លូនល្អជាងក្រោយប្រើអេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍ជាមួយ UV។ មូលហេតុដែលទំនងគឺការខូចខាតដោយពន្លឺតិចជាង មិនមែនជាអត្ថប្រយោជន៍ពីសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ខ្លួនវាទេ។ រក្សារយៈពេលប៉ះពន្លឺសឱ្យខ្លី ហើយបន្សុទ្ធ DNA ដែលបានស្រង់យកតាមដំណើរការស្រង់ DNA ពីជែលធម្មតា។

ភស្តុតាងសម្រាប់ PCR និងការកំណត់លំដាប់បាសមានតិចជាង។ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដែលនៅសល់ភ្ជាប់នឹងអាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីក ដូច្នេះត្រូវលាងជម្រះពណ៌ និងបន្សុទ្ធមុនជំហានដែលប្រើអង់ស៊ីម។ គេរំពឹងថា DNA ដែលបានបន្សុទ្ធត្រឹមត្រូវពីជែលពណ៌ខៀវអាចប្រើបាន ប៉ុន្តែកម្រិតដែលប៉ូលីមេរ៉ាស និងប្រព័ន្ធគីមីកំណត់លំដាប់បាសផ្សេងៗអាចទ្រាំទ្រសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដែលជាប់ចូលដោយផ្ទាល់ មិនទាន់ត្រូវបានវាស់វែងច្បាស់លាស់ទេ។ កុំសន្មតថាវាអាចទ្រាំទ្របាន។

ហាយប្រ៊ីដកម្មលើប្លតមានភាពឆបគ្នា នៅពេលអនុវត្តតាមលំដាប់យ៉ាងតឹងរ៉ឹង៖ ផ្ទេរ ចងឱ្យជាប់ ជ្រលក់ពណ៌ កត់ត្រា លាងជម្រះពណ៌ និងធ្វើហាយប្រ៊ីដកម្ម។ លំដាប់នេះជាការរចនារបស់ Herrin និង Schmidt។ ការជ្រលក់ពណ៌មុនផ្ទេរ ឬការរំលងការលាងជម្រះពណ៌ គឺជាវិធីសាស្ត្រផ្សេង ហើយត្រូវការការផ្ទៀងផ្ទាត់ដោយឡែក។ ក្រោយយកសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ចេញ ការដកប្រូប និងការប្រើប្រូបឡើងវិញតាមវិធីស្តង់ដារអាចបន្តបានធម្មតា។ សម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌កម្រិតកោសិកាដោយគ្រួសារសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ដូចគ្នា និងមូលហេតុដែលគោលការណ៍សម្រាប់ស្រទាប់សំណាកដែលបានចងឱ្យជាប់មិនអាចយកទៅប្រើក្នុងវិធីសាស្ត្រកោសិការស់ សូមមើលអាត្លាសការជ្រលក់ពណ៌សម្រាប់មីក្រូទស្សន៍។

ការកាត់យកបន្ទាត់អាចប្រើបានសម្រាប់អាហ្គារ៉ូសដែលត្រូវស្រង់យកសំណាកទៅប្រើបន្ត និងសម្រាប់អូលីហ្គូក្នុង PAGE ដែលកំណត់ទីតាំងដោយពណ៌ខៀវ ដរាបណាជៀសវាងវិធីកែប្រែដែលចងពណ៌ជាអចិន្ត្រៃយ៍។ ការស្រង់ចេញដោយអគ្គិសនីក្រោយលាងជម្រះពណ៌មានភាពសមហេតុផលផ្នែកគីមីសម្រាប់សារធាតុភ្ជាប់ដែលអាចបញ្ច្រាសបាន ប៉ុន្តែទិន្នន័យទិន្នផលពីការសាកល្បងមានការគ្រប់គ្រងដែលជាក់លាក់ចំពោះមេទីឡែនប្លូមានតិចតួច។ យកអំបិលចេញ ឬធ្វើកំណកក្រោយស្រង់ចេញ។

បញ្ហាដែលកើតឡើងដដែលៗ

បន្ទាត់ជែលស្រអាប់ជាធម្មតាមានន័យថាមានម៉ាសតិចពេកសម្រាប់ការជ្រលក់ពណ៌ដែលអានតាមពណ៌ ជាពិសេសសម្រាប់សំណាកគោលដៅខ្សែតែមួយខ្លី ឬ RNA។ ដាក់សំណាកច្រើនជាងមុន ប្រើសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ថ្មី ពន្យារពេលជ្រលក់មុនបង្កើនកំហាប់ ហើយបញ្ឈប់ការលាងជម្រះពណ៌ឱ្យឆាប់ជាងមុន។ ជែលពណ៌ខៀវទាំងមូលដែលគ្មានភាពផ្ទុយគ្នានៃពណ៌ ជាធម្មតាមានន័យថាជ្រលក់ពណ៌លើស ឬប្តូរទឹកតិចដងពេក។ បន្ទាត់ PAGE ដែលស្រកពណ៌ជាលទ្ធផលគីមីដែលរំពឹងទុក មិនមែនជាការជ្រលក់ពណ៌បរាជ័យទេ។ ថតរូបឱ្យលឿន។ ពណ៌ផ្ទៃខាងក្រោយមិនស្មើគ្នាលើភ្នាសបង្ហាញពីផ្នត់ ពពុះ ស្នាមម្រាមដៃ ការអង្រួនមិនស្មើគ្នា ឬការផ្ទេរមិនស្មើពេញផ្ទៃ។ កុំបកស្រាយថាជាការដាក់សំណាកមិនស្មើគ្នា ដោយគ្មានការត្រួតពិនិត្យតាមហាយប្រ៊ីដកម្ម។ លំនាំរីបូសូមខ្សោយ និងរអិលមិនច្បាស់អាចមានន័យថាសំណាកបានខូចបែក ប៉ុន្តែក៏អាចបណ្តាលពីការផ្ទេរមិនពេញលេញ RNA សរុបតិចពេក (គន្លងធម្មតាមានពីប៉ុន្មានទៅរាប់សិបមីក្រូក្រាម) ឬការលាងជម្រះពណ៌ច្រើនពេក។ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌បង្ហាញ RNA រីបូសូមដែលមានច្រើន។ វាមិនបង្ហាញត្រានស្គ្រីបជាក់លាក់ទេ។ ការងារនោះជាតួនាទីរបស់ប្រូប។

សុវត្ថិភាព និងការចាត់ចែងដោយមិនអះអាងហួសហេតុ

មេទីឡែនប្លូងាយចាត់ចែងជាងអេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍ ប៉ុន្តែមិនមែនគ្មានគ្រោះថ្នាក់ទេ។ សន្លឹកទិន្នន័យសុវត្ថិភាពបច្ចុប្បន្នរបស់ MilliporeSigma ចាត់ថ្នាក់សារធាតុជ្រលក់ពណ៌នេះក្នុងប្រភេទទី 4 នៃការពុលស្រួចស្រាវតាមមាត់ ដែលបង្កគ្រោះថ្នាក់បើលេបចូល និងតម្រូវឱ្យបោះចោលតាមប្រព័ន្ធកាកសំណល់ដែលបានអនុម័ត យោងតាម SDS មេទីឡែនប្លូរបស់ Sigma-Aldrich។ អេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍មានការព្រមានខ្លាំងជាងអំពីភាពពុលចំពោះសារធាតុហ្សែន រួមទាំងផលប៉ះពាល់ដែលសង្ស័យលើកោសិកាបន្តពូជក្នុង SDS អេទីដ្យូមប្រូម៉ាយដ៍របស់ Sigma-Aldrich ហើយជែល និងសូលុយស្យុងរបស់វាជាទូទៅត្រូវបានបែងចែកទុកជាកាកសំណល់គីមីគ្រោះថ្នាក់ ដូចដែលបានកត់សម្គាល់ក្នុងមគ្គុទ្ទេសក៍សារធាតុជ្រលក់ពណ៌អាស៊ីតនុយក្លេអ៊ីករបស់ Thermo Fisher។ អនុវត្តតាម SDS និងវិធានរបស់ស្ថាប័នសម្រាប់សារធាតុទាំងពីរ។ រក្សាសារធាតុជ្រលក់ពណ៌ស្ងួតឱ្យស្ងួត និងបិទជិត ប្រើសូលុយស្យុងជ្រលក់ពណ៌ឡើងវិញតែតាមការអនុញ្ញាតរបស់ពិធីការ រក្សាភ្នាសដែលបានជ្រលក់ពណ៌ឱ្យស្ងួតនៅចន្លោះសន្លឹកក្រដាសតម្រង ហើយថតរូបជែលមុនបន្ទាត់សាយចេញ។

ចងចាំប្រយោគសម្រាប់តុពិសោធន៍នេះ។ ជែលពិនិត្យភាពមើលឃើញនៅពេលដាក់សំណាកច្រើនក្រោមពន្លឺស។ ភ្នាសពិនិត្យការផ្ទេរ និងការដាក់សំណាក មុនពេលប្រូបធ្វើការរកឃើញដែលមានភាពរសើបខ្ពស់។ សារធាតុជ្រលក់ពណ៌មួយបម្រើកិច្ចការទាំងពីរ ដោយមានភាពរសើបកម្រិតមធ្យម ការភ្ជាប់ដែលអាចបញ្ច្រាសបាន និងលំដាប់ប្រតិបត្តិការយ៉ាងតឹងរ៉ឹង។