Метилен көгінің калибрлеу қисығын құру: бос үлгілер, ауқым және сызықтылық

Екі талдаушы метилен көгінің бір бастапқы ерітіндісін пайдаланып, әрқайсысы калибрлеу қисығын құрады. Біріншісі координаталар басынан өтетін түзу сызық алып, белгісіз үлгілерді сеніммен өлшейді. Екіншісінің қисығы жоғарғы бөлігінде иіледі, бос мүшесі нөлге жақындамайды, ал үлгілердің нәтижелері сұйылтқан сайын өзгереді. Бояғыш та, аспап та, толқын ұзындығы да бірдей. Айырмашылық шеберлікте емес. Ол тәжірибені жоспарлауда: бос үлгіге не қосылғанында, қандай концентрациялар таңдалғанында және тексерілген ауқымда бір қарапайым модельдің әлі де жарамды болған-болмағанында.

Калибрлеу қисығы — аспап жауабы мен концентрация арасындағы, тек өзі құрылған жағдайларда ғана жарамды келісім. Метилен көгі үшін бұл келісімнің белгілі әлсіз тұсы бар. Бояғыш суда өзара ассоциацияланады, сондықтан жарықты жұтатын бөлшектердің түрі концентрацияға қарай өзгереді. Осы өзгерісті қамтитын қисық түзу болмайды және оны ешқандай статистикалық әдіс түзете алмайды. Бұл мақала сызықтың мәні болуы үшін қисықты қалай жоспарлау керектігін көрсетеді: дұрыс бос үлгіні таңдау, ауқымды мономер басым аймақта ұстау, қайталауларды дұрыс орындау және қисықтың иілуін шу емес, ақпарат деп қарастыру.

Стандарттардан емес, бос үлгіден бастаңыз

Бос үлгі нөлді анықтайды, ал метилен көгі үшін оның құрамында бояғыштан басқасының бәрі болуы тиіс. Судың сапа санаты, буфер мен pH, тұздар, қосалқы еріткіштің үлесі және температура бірдей болуы керек. Калибрлеу ерітінділерін дәл сондай матрицада дайындаңыз. Мұның себебі формалдық талапта емес, химияда. Тұз бен еріткіш мономер, димер және жоғары агрегаттар арасындағы тепе-теңдікті өзгертеді, соның салдарынан өлшеу толқын ұзындығындағы спектр де өзгереді. Тек судан тұратын бос үлгі матрица әсерінен молекулалық түрлер құрамының өзгеруін түзете алмайды. Ашық қолжетімді жазбасы арқылы оқуға болатын метилен көгінің судағы спектрлерін кешенді талдау зерттеуінде натрий хлоридінің концентрациясы 0-ден 0.15 M-ге дейін өзгертілген. Себебі иондық күш тепе-теңдікті ығыстырады, ал тұз мөлшері артқан сайын агрегация күшейген.

Бұдан шығатын бір практикалық қорытынды: ешқашан деиондалған суда калибрлеп, содан кейін фосфат буферіндегі немесе ағынды су сүзіндісіндегі үлгілерді өлшемеңіз. Анықталатын зат жоқ матрица қолжетімсіз болса, үлгінің өзіне стандарт қосу матрицасы сәйкес емес сыртқы қисықтан жақсырақ. Сулы ортадағы талдаулардың дұрыстығын сақтауға қатысты нұсқаулар матрица мен кедергі әсерлерін талқылауда берілген, ал бояғыштарды сандық анықтаудың жалпы қағидалары талдауды жоспарлау шолуында қарастырылған.

Бір молекулалық түр басым болатын ауқымды таңдаңыз

664 nm маңындағы ұзын толқынды жолақ бойынша сандық анықтау бояғыштың басым бөлігі мономер түрінде болады деген жорамалға сүйенеді. Таза суда бұл жорамал ерітінділер сұйылтылған күйде, шамамен төмен микромолярлық аймақта болғанда ғана орындалады. Жарияланған эмпирикалық көлбеулік мәндері осы шекараны көрсетеді: 1 cm кюветаларда шамамен 7 микромолярдан төмен жүргізілген калибрлеулерде көлбеулік шамамен 82,000 M-1 cm-1 болады, ал ауқым шамамен 37 микромолярға дейін кеңейтілсе, ол шамамен 67,100-ге түседі, өйткені жоғарғы стандарттарда димердің елеулі мөлшері бар. Мұнда келтірілген әр коэффициенттің жағдайлары метилен көгінің спектрлік анықтамалығында көрсетілген; мәндерді салыстыру үшін сол дереккөзге жүгінген дұрыс. Бұл мақала оларды тек ауқымды белгілеу үшін пайдаланады.

Жоспарлау ережелері осыдан тікелей шығады:

1. Ең жоғары стандарт спектр пішіні тұрақты қалатындай жеткілікті сұйылтылған болуы керек. Әдісті әзірлеу кезінде бір толқын ұзындығында ғана өлшемей, әр деңгей үшін бүкіл көрінетін ауқымды (шамамен 550-ден 750 nm-ге дейін) сканерлеңіз. Егер нормаланған спектрлердің пішіні концентрацияға қарай өзгерсе, химиялық күй өзгеріп жатыр және ауқым тым кең.
2. Әр деңгейде 610 nm маңындағы оптикалық тығыздықтың 665 nm маңындағы оптикалық тығыздыққа қатынасын бақылаңыз. Бұл қатынас концентрация артқан сайын өссе, димерге тән иықтың күшейгенін және мономер моделінің жарамсыз бола бастағанын білдіреді. Бұл диагностикалық белгі агрегация мен концентрация әсерлері жөніндегі нұсқаулықта толығырақ түсіндірілген.
3. Төмен микромолярлық концентрациялармен жұмыс істеу үшін 1 cm кюветаны пайдаланыңыз. Көлбеулік шамамен 82,000 болғанда, 5 микромоляр оптикалық тығыздықтың шамамен 0.41 мәнін, ал 10 микромоляр шамамен 0.82 мәнін береді; екеуі де аспаптардың көпшілігі үшін қолайлы.
4. Концентрлі бастапқы ерітінділер үшін оптикалық тығыздықтың 1-ден әлдеқайда жоғары болуына келісе салмай, оптикалық жолды қысқартыңыз. Бірақ қысқа жол химияны емес, фотометрияны түзететінін ұмытпаңыз. Агрегация жол ұзындығына емес, концентрацияға тәуелді, сондықтан концентрлі бастапқы ерітіндіге сұйылтылған мономер қисығын қолданудың орнына, оның молекулалық түрлер құрамын ескеретін жеке тәсіл қажет.

Осы көріністің едәуір бөлігіне негіз болған кешенді модель сәйкестендіру 1.1 микромолярдан 3.4 миллимолярға дейінгі 224 спектрді қамтыған және тетрамер сигналының 34 микромолярдан төменде-ақ анықталатынын көрсеткен. Бұл нәтиже сақ болуға шақырады: сызықтық аймақ түйсікпен болжағаннан тар, сондықтан оны бар деп қабылдамай, тексеріңіз.

Деңгейлер, қайталаулар және өлшеу реті

Үш нүктеден тұратын қисық ештеңені дәлелдемейді. ICH Q2(R2) валидация нұсқаулығы сызықтылықты бағалау үшін кемінде бес концентрацияны талап етеді, ал нөлден өзгеше алты-сегіз деңгей, әсіресе агрегация басталатын жоғарғы бөлікте, сенімдірек жұмыс қисығын береді. Деңгейлерді жай ғана ыңғайлы геометриялық қатармен таңдамаңыз: олар көзделген үлгі ауқымын қамтып, иілу ықтималдығы ең жоғары аймақта жиірек орналасуы керек.

Әр деңгейді бір колбадан үш рет өлшеудің орнына, тәуелсіз дайындалған ерітінділермен екі немесе үш қайталауда өлшеңіз. Тәуелсіз қайталаулар дайындау қатесін ашады; бір колбаны қайта-қайта өлшеу тек аспап шуын көрсетеді. 2020 жылғы кешенді зерттеуде әр ерітінді үш рет өлшенген, бұл әлі де орынды бастапқы тәсіл болып саналады. Дрейф, шыныға адсорбциялану немесе температура өзгерісі қисықтың иілуі болып көрінбеуі үшін өлшеу ретін кездейсоқ таңдаңыз. Кварц кюветаларға жүргізілген зерттеу 34 микромоляр ерітіндіден бояғыштың шамамен 3 пайызы 10 минут ішінде адсорбцияланатынын анықтаған. Сондықтан бүкіл өлшеу сериясында жанасу уақытын, кюветаны, тазалау тәртібін және өлшеу ретін бірізді ұстаңыз.

Көрнекі есептеу мысалы (өлшенген деректер емес)

Төмендегі сандар есептеуді көрсету үшін ойдан алынған. Олар зертханалық өлшеулер емес және метилен көгі туралы деректер ретінде дәйексөзге алынбауы тиіс. Маңыздысы — осы сандарға қатысты тексерулердің жүйесі.

Матрицасы сәйкес буфердегі алты стандарт 1 cm оптикалық жолмен, сәйкес бос үлгіге қатысты 665 nm-де өлшенді делік:

Орташа оптикалық тығыздықтың концентрацияға тәуелділігін түзу сызықпен жуықтау бір микромолярға шамамен 0.0805 оптикалық тығыздық бірлігіне тең көлбеулікті және нөлден бірнеше миллиоптикалық тығыздық бірлігі ғана ауытқитын бос мүшені береді. Көлбеулікті оптикалық жол ұзындығына бөлу оны көрінерлік жұту коэффициентіне айналдырады: бір микромолярға 0.0805 шамамен 80,500 M-1 cm-1 мәніне тең, бұл суда мономер басым болатын аралыққа сәйкес келеді. Мұнда маңызды тексеру — R квадраты емес, өйткені ол екі жағдайда да өте жақсы көрінуі мүмкін. Маңыздысы — нөлге жақын бос мүше, S2-ден S5-ке дейінгі тұрақты A610/A665 қатынасы және айқын үрдіссіз шашыраған қалдықтар. S6 деңгейіндегі қатынастың өсуі осы деңгейді алып тастауға немесе 7 микромолярды осы матрица мен аспап үйлесімінің уақытша жоғарғы шегі ретінде белгілеуге негіз болатын нақты сигнал.

Дәл сондай жағдайларда белгісіз үлгінің көрсеткіші 0.245 болса, ол тікелей есептеледі: 0.245-ті бір микромолярға 0.0805 мәніне бөлу, үлгінің қандай да бір сұйылту коэффициентін қолданғанға дейін, шамамен 3.0 микромоляр береді. Нәтижені жағдайларымен бірге көрсетіңіз: толқын ұзындығы, оптикалық жол, бос үлгі матрицасы, калибрлеу аралығы және күні.

Толтырылатын калибрлеу жұмыс парағы

Әр жаңа матрица үшін осы үлгіні зертханалық жазбаға көшіріңіз. Бір матрица, бір парақ, бір қисық.

Реагент түріне арналған жол бекер енгізілмеген. Сатылатын метилен көгі сусыз тұз немесе тригидрат сияқты гидрат болуы мүмкін, ал қате молярлық масса әр номиналды концентрацияны байқатпай бұрмалайды. Бастапқы материалдың тазалығы мен спецификацияға сәйкестігін тексеру сапа және сапа санаттары жөніндегі нұсқаулықта қарастырылған.

Тәуелсіз бақылау стандартымен тексеріңіз

Калибрлеу қисығы өз дұрыстығын өзі бағаламауы керек. Модельді сәйкестендіргеннен кейін бөлек өлшендіден дайындалған бастапқы ерітіндіні пайдаланып, қабылданған аралықтың ортасына жақын концентрацияда бір бақылау стандартын дайындаңыз және оны белгісіз үлгі ретінде өлшеңіз. Нәтиженің күтілетін мәнмен бірнеше пайыз шегінде сәйкес келуі дайындау тізбегінің дұрыстығын растайды; сәйкес келмеуі аспаптан гөрі бастапқы ерітіндіге немесе сұйылтуларға күмән тудырады. Әр үлгі партиясымен бірге бақылау стандартын қайта өлшеңіз. Қисық өзгермей, оның нәтижесі ығысса, алдымен үлгілерді емес, жұмыс ерітінділерін немесе кюветаны тексеріңіз. Осы бір әдет байқалмайтын қателердің көбін анықтайды: сусыз реагентке гидраттың молярлық массасын қолдану, калибрлеуі бұзылған микропипетка, иондық күші қате дайындалған буфер. Бақылау стандартының табылған мөлшерінің күтілетін мөлшерге пайыздық қатынасын жұмыс парағында көлбеуліктің жанына жазыңыз. Сонда кейін оқитын адам сызықтың жай сызылмай, тексерілгенін көре алады.

Сызықтық еместікті диагностикалық белгі ретінде түсіндіру

Қисық иілгенде, ауытқудың пішіні оның себебін көрсетеді. Спектр пішіні өзгермей, жоғары оптикалық тығыздықта қисықтың төмен қарай иілуі аспапқа меңзейді: көбіне бөгде жарық жоғары оптикалық тығыздық мәндерін төмендетіп көрсетеді. Иілумен қатар 610 nm-дегі иықтың өсуі химиялық себепке нұсқайды: димер мен жоғары агрегаттар жарықты мономерден өзгеше жұтады. Нөлге келмейтін бос үлгі немесе көрсеткіштері уақыт өте төмендейтін стандарттар ыдысқа меңзейді: шыныға не кюветаларға адсорбциялану, әсіресе өлшеу сериясында жанасу уақыттары әртүрлі болғанда. Ал нүктелер арқылы өтетін анық түзу сызық үлгілер үшін бәрібір қате нәтиже берсе, себеп матрицада: үлгілер калибрлеу ерітінділерінен өзгеше. Сондықтан қисықты үлгі матрицасында қайта құрыңыз немесе стандарт қосу әдісіне көшіңіз. Барлық жағдайда қалдықтардың концентрацияға тәуелділік графигін салыңыз. Кездейсоқ шашырау түзу сызық моделін қолдайды; ал жоғары не төмен доға түріндегі жүйелі пішін оны кез келген R квадратының шекті мәнінен сенімдірек жоққа шығарады. Валидация нұсқаулығы бұл қағиданы тікелей қолдайды.

Метилен көгімен жұмыс істегенде мұндай тәртіптің пайдасы зор. Оның мономер жолағы күшті, химиялық қасиеттері жақсы зерттелген, ал ауытқу түрлері сандарды бұрмаламай тұрып-ақ спектрден көрінеді. Қисықты тар ауқымда құрыңыз, бос үлгіні дұрыс пайдаланыңыз, қайталауларды тәуелсіз дайындаңыз және ауқымды таңдауда спектр пішінін басшылыққа алыңыз. Алынған сызық қысқа болады, бірақ ондағы әр нүкте шынайы.

Бұл мақаладағы көрнекі есептеулер әдісті көрсету үшін ойдан алынған сандарды пайдаланады. Толық жағдайлары көрсетілген өлшенген анықтамалық коэффициенттер сілтеме берілген спектрлік анықтамалықта келтірілген, ал негізгі агрегация зерттеуі PMID 33251415 нөмірімен индекстелген.