Метилен көгі және қабыну сигналдары: инфламмасомалар, IL-6 және STAT3

Үш зертхана бір көк қосылыстың қабынуға қарсы әсері бар екенін хабарлады делік. Біріншісі макрофагтардан IL-1beta аз бөлінетінін көрсетеді. Екіншісі сол жасуша түрінде iNOS ферменті азаятынын көрсетеді. Үшіншісі қанда IL-6 мөлшері және мида STAT3 белсенділігі төмендейтінін көрсетеді. Осы үшеуін бір тұжырымға біріктіргіңіз келуі мүмкін. Бірақ мұндай біріктіру зерттеу нәтижесінің мәнін көмескілейді.

Әр нәтиже өзіне тән іске қосушы факторы, құралу кезеңі және өлшенетін көрсеткіші бар бөлек сигналдық механизмге жатады. Метилен көгі әр механизмге әртүрлі нүктеде әсер етеді. Мұның денсаулық нәтижелерін жақсартатыны не жақсартпайтыны — бөлек мәселе; ол метилен көгі мен қабыну туралы шолуымызда қарастырылған. Бұл бетте тек сигналдық жолдар талданады.

1-жол: инфламмасоманың құралуы және caspase-1

Инфламмасома — миелоидты жасушаның ішінде қажет кезде құралатын ақуыздық қаңқа. Оның бөліктері: сенсор, ASC деп аталатын адаптор және caspase-1 деп аталатын эффекторлық фермент. Құралғаннан кейін caspase-1 pro-IL-1beta мен pro-IL-18-ді бөлініп шығатын түрлеріне дейін ыдыратады және жасуша өлімінің қабынумен жүретін түрі — пироптозды іске қоса алады. Инфламмасоманың түрін сенсор анықтайды: NLRP3 кристалдарға және нигерицин мен ATP сияқты тесік түзетін токсиндерге жауап береді, NLRC4 бактериялық флагеллинге, AIM2 цитозольдегі қос тізбекті DNA-ға, ал канондық емес жол жасушаішілік липополисахаридке жауап береді.

Белсену үшін екі сигнал қажет. Бірінші сигнал — алдын ала дайындау: Toll-тәрізді рецептордың лиганды NLRP3 пен pro-IL-1beta-ның NF-kB-тәуелді транскрипциясын іске қосып, қажетті бөліктердің түзілуін қамтамасыз етеді. Екінші сигнал — құралу: екінші іске қосушы фактор ASC-нің олигомерленіп, нүктелік шоғырлар түзуіне, caspase-1-дің p20 фрагментіне дейін ыдырауына және жетілген IL-1beta p17-нің бөлініп шығуына әкеледі. Митохондриялық реактивті оттек түрлері мен кристалдардың жұтылуы NLRP3 үшін екінші сигналға ықпал ететін белгілі факторлар.

2017 жылғы макрофагтардағы инфламмасомалардың кең ауқымды тежелуін зерттеу метилен көгін екі сигнал кезеңінде де сынады. Липополисахаридпен алдын ала дайындалған тышқан сүйек кемігінің макрофагтарында нигерицин, ATP және мононатрий уратының кристалдары әрқайсысы IL-1beta мен caspase-1 бөлінуін және ASC нүктелік шоғырларының түзілуін туғызды. Ал 20-дан 200 микромолярға дейінгі концентрациядағы метилен көгі жасушаларды өлтірмей, осы үш көрсеткіштің бәрін дозаға тәуелді түрде төмендетті. NLRC4 үшін флагеллин мен Salmonella, AIM2 үшін қос тізбекті DNA мен Listeria, ал канондық емес жол үшін трансфекция арқылы енгізілген липополисахарид немесе тірі E. coli қолданылғанда да дәл осындай заңдылық байқалды. Қосылыстың өзі бөлінуді іске қоспады, ал бақылау планшеттері бактерияға қарсы әсердің жоқ екенін көрсетті. Демек, нәтиже ағзаның жауап реакциясына қатысты.

Жолдың жоғары тұрған кезеңдерінде үш әсер өлшенді. Ротенон туғызған митохондриялық супероксид мөлшері метилен көгінің қатысуымен азайды, сонымен бірге ротенон әсерінен IL-1beta бөлінуі де төмендеді. Флуоресцентті түйіршіктердің жұтылуы азайды, бұл кристалдарды танудан бұрын фагоцитоздың төмендеуіне сәйкес келеді. Екі NF-kB байланысу орны бар NLRP3 промоторы басқаратын репортердің белсенділігі метилен көгінің қатысуымен төмендеді, ал сол орындары жоқ қысқартылған промотор жауап бермеді. Жасушасыз сынауықта метилен көгі адамның рекомбинантты caspase-1 белсенділігін де тікелей төмендетті. Қосылысты тек алдын ала дайындау кезінде немесе тек белсену кезінде қосқанда да IL-1beta, IL-18 және caspase-1 бөлінуі азайды. Демек, екі кезең де қамтылған.

Тышқандардағы сынақтар осы таңдамалылыққа сәйкес келді. Липополисахаридтің өлімге әкелетін дозасы бақылау тобындағы тышқандарды бірнеше сағат ішінде өлтірді, ал метилен көгі тірі қалу көрсеткішін жақсартты; құрсақ қуысындағы IL-1beta азайды, бірақ сол сұйықтықтағы IL-6 азаймады. Listeria туғызған перитонит моделінде құрсақ қуысындағы IL-1beta төмендеді, ал жасушалардың жалпы саны өзгермеді. Адамның THP-1 моноциттері инфламмасоманың барлық төрт түрінде тышқан макрофагтары сияқты жауап берді. Инфламмасомаға қатысты нәтиже барлық цитокинді емес, IL-1beta мен IL-18-дің жетілуін түсіндіреді. Сондықтан микроглия мен астроциттерге жүргізілген тәжірибелердегі ми иммундық жасушаларының пішіні қаңқаның құралуынан бөлек сұраққа жауап береді.

2-жол: NF-kB мен STAT1 байланысуы арқылы iNOS транскрипциясы

Индукцияланатын азот тотығы синтазасы, яғни iNOS, тыныштық күйінде өте аз болады және қажет кезде транскрипцияланады. Липополисахарид оны негізінен IkB-alpha ыдырауы, содан кейін NF-kB фосфорлануы және ядроға енуі арқылы іске қосады. Интерферон-гамма оны негізінен Янус киназасының STAT1-ді фосфорлауы, содан кейін STAT1-дің ядроға енуі арқылы іске қосады. Бұдан соң әр фактор iNOS промоторындағы өз орнына байланысады. Фермент белсенділігі мен ген индукциясы — бөлек бақылау нүктелері, ал дәрілік зат олардың біріне немесе екеуіне де әсер ете алады.

2015 жылғы макрофагтар мен эндотоксемиясы бар тышқандардағы iNOS индукциясын зерттеу әсердің ақпараттық РНҚ деңгейінде болатынын көрсетті. RAW 264.7 жасушаларында және тышқанның бастапқы макрофагтарында липополисахарид, интерферон-гамма немесе екеуі қатар берілерден 30 минут бұрын енгізілген 1 микромоляр метилен көгі 8-ден 24 сағатқа дейінгі аралықта iNOS ақуызы мен mRNA мөлшерін азайтты. Қоректік ортадағы нитрит мөлшері де төмендеді, ал жасушалардың тіршілік қабілеті сақталды. Липополисахарид kg-ға 25 mg мөлшерінде берілген тышқандарда одан бір сағат бұрын енгізілген kg-ға 5 mg бір реттік доза өкпедегі, бауырдағы және жүректегі iNOS ақуызы мен mRNA мөлшерін азайтты.

Мұндағы ерекше жайт — кейбір үдерістердің өзгермеуі. IkB-alpha ыдырауы, NF-kB фосфорлануы, STAT1 фосфорлануы және екі фактордың да ядроға жиналуы сақталды. Үзіліс бір кезең кейінірек болды: ядролық экстракттар липополисахаридтен кейін NF-kB-ның өз DNA элементімен байланысуы және интерферон-гаммадан кейін STAT1 байланысуы азайғанын көрсетті. Ал хроматинді иммунопреципитациялау жасуша ішіндегі iNOS промоторында екі фактордың да байланысуы азайғанын растады. Промоторы да NF-kB-ны пайдаланатын ісік некрозының альфа факторы да төмендеді. Факторлар белсеніп, тиісті жерге жеткенімен, нысана DNA-мен нашар байланысқан.

1-жолмен айырмашылығына назар аударыңыз. Бұл фактордың DNA-мен байланысуына қатысты, STAT3 емес, STAT1 пайдаланылады және ASC нүктелік шоғырлары мен caspase-1 фрагменттерінің орнына mRNA, ақуыз және нитрит өлшенеді. Жасушалық модельдердегі метилен көгі нысаналарының картасында біз осы транскрипциялық деңгейді ферментке тікелей әсер ету және митохондриялық өлшемдерден бөлек қарастырамыз.

3-жол: қан сарысуындағы IL-6 және тіндердегі STAT3 белсенуі

IL-6 gp130 рецепторлар тобы арқылы Янус киназасынан STAT3-ке өтетін каскадқа сигнал береді. Фосфорланған STAT3 димерленіп, ядроға енеді және қабыну бағдарламаларын іске қосады. Ал IL-6-ның өзі NF-kB нысанасы болғандықтан, екеуі көбіне IL-6–STAT3 осі деп аталатын кері байланыс ілмегін құрайды. Әдеттегі өлшенетін көрсеткіштер — жолдың жоғарғы бөлігіндегі қан сарысуының IL-6 мөлшері, фосфорланған STAT3-тің жалпы STAT3-ке қатынасы және жолдың төменгі бөлігіндегі iNOS пен COX2 сияқты эффекторлық ферменттер.

2023 жылғы липополисахаридтен кейін тышқандардағы IL-6 мен STAT3-ті зерттеу осы осьті әртүрлі биологиялық орталарда өлшеді. Еркек C57BL/6 тышқандарына үш күн бойы күн сайын kg-ға 1 mg липополисахарид беріліп, әр дозадан 30 минут кейін kg-ға 5 немесе 10 mg метилен көгі енгізілді. Үшінші күні метилен көгін алған екі топта да қан сарысуындағы IL-6 тек липополисахарид алған топқа қарағанда төмен болды. Ал панельдегі басқа цитокиндердің басым бөлігі енгізілген заттың әсерінен өзгермеді. Ми қыртысында, гиппокампта және құлақ терісінде фосфорланған STAT3-тің жалпы STAT3-ке қатынасы төмендеді. Сонымен бірге микроглияның Iba-1 бойынша боялуы, iNOS пен COX2 мөлшері азайып, салмақ жоғалту ішінара бәсеңдеді.

Бұл жерде екі ескертуді ескеру керек. Қан сарысуындағы IL-6 төмендеуі мен тіндердегі STAT3 фосфорлануының азаюы осьтің модуляциясына сәйкес келеді, бірақ негізгі әсер нүктесін анықтамайды. Себебі жоғары тұрған цитокин мөлшерінің азаюы, рецепторлық сигналдың әлсіреуі немесе фосфатаза белсенділігінің өзгеруі бірдей қатынасқа әкелуі мүмкін. Сондай-ақ жедел әсердің үш күніндегі салмақ — симптом не ремиссия бағасы емес, тұтас жануар деңгейіндегі көрсеткіш. Ол сигналдық нәтижені емдеу туралы тұжырымға айналдырмай, иммуноблоттан тыс қосымша мәнмәтін береді. Митохондриядағы тотығу-тотықсыздану үдерістерін реттеудің бөлек химиясы осы цитокиндік үдерістермен қатар жүреді және олармен біріктірілмеуі тиіс.

Жолдарды салыстыру: әсер ету нүктелері және өлшенетін көрсеткіштер

Кесте үш негізсіз қорытындыға жол бермейді. ASC нүктелік шоғырларына қатысты нәтиже STAT3-ке қатысты нәтижені дәлелдемейді. Екі ақуыз да STAT тобына жатса да, STAT1-дің iNOS промоторымен байланысуына қатысты нәтиже STAT3-ке қатысты нәтижені дәлелдемейді. Қан сарысуындағы IL-6 нәтижесі инфламмасома құралуының азайғанын дәлелдемейді: құрсақ қуысына жүргізілген тәжірибеде IL-1beta төмендеді, ал IL-6 төмендемеді. Әр жол үшін өзінің іске қосушы факторы мен өлшенетін көрсеткіші қажет. Сондықтан метилен көгі туралы жасушалық, жануарлық және клиникалық зерттеулерді оқығанда әр тұжырымды ол өлшенген деңгеймен сәйкестендіру керек.

Бұлардың ешқайсысы адамдардағы дозалауды, қауіпсіздікті немесе пайданы анықтамайды. Липополисахарид модельдері — созылмалы аурудың көшірмесі емес, механизмді тексеруге арналған бақыланатын іске қосушы факторлар. Ал затты іске қосушы фактормен қатар енгізу қалыптасқан ауруды кері қайтаруды емес, әдейі туғызылған өзгерістің алдын алуды сынайды. Осы механизмдер туралы мәліметті пациенттердегі нәтижелерден бөлек қарастырып, денсаулыққа қатысты кез келген тұжырымды оның негізіндегі пациенттерге жүргізілген зерттеу бойынша бағалаңыз.