G6PD зертханалық сынақтарындағы метилен көгі: бояғыш шын мәнінде не істейді

Студент инкубациядан кейін екі сынауықты бақылайды. Біреуінің түсі күтілгендей өзгерген. Екіншісінікі өзгермеген. Студент екінші пациентте глюкоза-6-фосфатдегидрогеназа тапшылығы бар деген қорытынды жасайды. Бұл қорытынды дұрыс болуы мүмкін, бірақ оның пайымдауы сынақтың жұмыс істеу негізін ескермейді. Сынауықтағы ешбір нәрсе ферментті тікелей өлшемейді. Сынауық метилен көгін делдал ретінде пайдаланып, фермент түзетін өнімді өлшейді.

Осы жанама өлшеу қағидаты түсінікті болғанда, рәсім де, бақылау үлгілері де, жалған нәтижелердің ұзақ тізімі де кездейсоқ нәрсе болып көрінбейді.

Қысқаша жауап

G6PD сынағында метилен көгі тотығу-тотықсыздану индикаторы қызметін атқарады. G6PD ферменті NADPH түзеді, ал NADPH-қа тәуелді жүйелер көк түсті метилен көгін оның түссіз лейкоформасына дейін тотықсыздандырады немесе оны электрондарды тасымалдау үшін пайдаланады. Ферменттің қалыпты белсенділігі тиімді тотықсыздануды қамтамасыз етеді. Белсенділік жеткіліксіз болса, тотықсыздану баяу жүреді немесе толық аяқталмайды. Сынақтың бүкіл сигналы осыған негізделген.

Тарихи екі әдісте бір бояғыш қолданылады, бірақ олардың соңғы көрсеткіштері әртүрлі. Оларды ажырата білсеңіз, шатасудың басым бөлігі жойылады.

Екі сынақ, бір бояғыш, әртүрлі соңғы көрсеткіштер

Біріншісі — Сасс пен әріптестері сипаттап, кейін Гиббс бағалаған метилен көгін тікелей тотықсыздандыру сынағы. Мұнда соңғы көрсеткіш — бояғыштың өзі: тотыққан көк түсті метилен көгі түссіз лейкометилен көгіне дейін тотықсызданады, ал осы өзгерістің жылдамдығы NADPH түзу қабілетін көрсетеді. Скринингке арналған бастапқы мақала PubMed базасында Сасс және әріптестері (1966) атымен тіркелген.

Екіншісі — Бруэрдің метгемоглобинді тотықсыздандыру сынағы. Алдымен натрий нитриті гемоглобинді қоңыр түсті метгемоглобинге дейін тотықтырады. Содан кейін метилен көгі электрондарды тасымалдаушы делдал ретінде әрекет етеді: тотықсызданған метилен көгі тотықсыздандыру эквиваленттерін метгемоглобинге беріп, оны қайтадан қызыл түсті гемоглобинге айналдырады. Сондықтан көзге көрінетін соңғы көрсеткіш көк пен түссіздің емес, қоңыр мен қызылдың айырмасы болады. Бастапқы әдіс Дүниежүзілік денсаулық сақтау ұйымының бюллетенінде (Бруэр және әріптестері, 1960) жарияланған.

Бруэр әдісін бояғышты түссіздендіру сынағы деп атау химиялық тұрғыдан дәл емес. Бояғыш циклдік өзгерістерден өтеді, ал түсін өзгертетін — гемоглобин. Төмендегі сызба екі жолды да көрсетеді.

Негізгі реакция

G6PD пентозофосфат жолының алғашқы тотығу сатысын катализдейді:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Жетілген эритроциттер NADPH алу үшін осы жолға айтарлықтай тәуелді. Бұл Луццатто мен әріптестерінің Blood журналындағы шолуында (2020) қарастырылған. NADPH глутатионды тотықсызданған күйде ұстап, жасушаны тотығудан болатын зақымданудан қорғайды. Метилен көгі осы жүйеге электрон акцепторы ретінде қатысады. G6PD жеткілікті болса, NADPH жеткілікті түзіледі, ал бұл тиімді тотықсыздануды қамтамасыз етеді. G6PD аз болғанда, тізбек алғашқы буынынан үзіледі.

Бояғышты қозғалтқыш емес, жанармай деңгейінің көрсеткіші деп елестетіңіз. Ол NADPH қоры туралы ақпарат береді. Осы қорды немесе өлшеу нәтижесін өзгертетін кез келген басқа фактор генде еш өзгеріс болмаса да көрсеткішті жылжытуы мүмкін.

Бруэр үлгісіндегі рәсім қалай орындалады

Реагенттердің құрамы ондаған жыл бойы өзгеріп отырған, сондықтан оқу мақсатындағы сипаттаманы клиникалық хаттама деп қабылдауға болмайды. Әр зертхана өзінің валидацияланған стандартты операциялық рәсімін ұстанады. Осы ескертуді ескере отырып, классикалық сынауық әдісі төмендегідей орындалады; үш сынауық пен 3 сағаттық инкубация қолданылған нұсқа осы жарияланған зерттеуде сипатталған:

1. Пациент сынауығы: тұтас қанға глюкоза, натрий нитриті және метилен көгі қосылады. Нитрит метгемоглобин түзеді, глюкоза эритроциттердің метаболизмін қамтамасыз етеді, ал бояғыш NADPH-қа тәуелді электрон тасымалдаушы қызметін атқарады.
2. Тотыққан бақылау үлгісі: қанға нитрит пен глюкоза қосылады, бірақ метилен көгі қосылмайды. Ол метгемоглобиннің қоңыр түсті соңғы күйін, яғни тапшылыққа тән көріністі көрсетеді.
3. Гемоглобиннің бақылау үлгісі: қанға су қосылады. Ол гемоглобиннің қызыл түсті соңғы күйін, яғни қалыпты көріністі көрсетеді.
4. Барлық сынауықтарды шамамен 37 C температурада, әдетте 3 сағат бойы, ақырын араластырып инкубациялаңыз.
5. Жасушаларды лизиске ұшыратып, түстерді салыстыруды жеңілдету үшін әр сынауықтан алынған шағын аликвотаны дистилденген сумен сұйылтыңыз.
6. Пациент сынауығын екі бақылау үлгісімен салыстырыңыз. Түстің қызылға қайта ауысуы елеулі тотықсыздандыру қабілетін көрсетеді. Қоңыр түстің сақталуы айқын тапшылықты меңзейді.

Тарихи құрамдардың бірінде шамамен 1 mL қан және концентрациялары шамамен 180 mM натрий нитриті, 280 mM декстроза және 0.4 mM метилен көгі болатын реагенттер қолданылған. Бұл сандарды әмбебап талап емес, әдебиеттегі мысал ретінде қабылдаңыз.

Нәтижені түсіндіру

Сапалық скрининг қалыпты белсенділіктің шамамен 30–40 пайызы аралығында ең жақсы ажыратады. Бұл Malaria Journal журналындағы G6PD анықтаудағы олқылықтар туралы шолуда талқыланған. Сондықтан қалыпты скрининг нәтижесі сынақ ауыр тапшылықты анықтамағанын білдіреді. Ол белсенділіктің толық қалыпты екенін растамайды.

Скрининг неліктен жаңылыстырады

Гемолизден кейінгі ретикулоцитоз — жалған қалыпты нәтиженің классикалық себебі. Жас эритроциттер мен ретикулоциттерде G6PD мөлшері ескі жасушаларға қарағанда көбірек болады. Жедел гемолиз эпизоды кезінде ең ескі және фермент тапшылығы ең айқын жасушалар жойылып үлгеруі мүмкін. Сонда белсенділігі сынақта қалыпты болып көрінетін жас жасушалар популяциясы қалады. Бұл биологиялық құбылыс бояғышқа негізделген скринингті ғана емес, сандық талдауларды да жаңылыстырады.

Жуырда қан құйылуы тапшылықты бүркемелейді, себебі донор эритроциттері үлгіге өз ферментін қосады. Mayo Clinic Laboratories қан құюды ретикулоцитоз және лейкоциттердің кедергі келтіруімен қатар фермент нәтижелерінің сенімсіз болу себептерінің бірі ретінде атайды.

Гетерозиготалы әйелдер — ең күрделі жағдай. X-хромосоманың кездейсоқ инактивациясы қалыпты және ферменті тапшы эритроциттердің қоспасын түзеді. Жалпы белсенділік айқын тапшылықтан сырттай қалыпты көрінетін деңгейге дейін кез келген аралықта болуы мүмкін. Сапалық скрининг аралық фенотиптерді жиі анықтамайды. ДДСҰ-ның G6PD сынақтары туралы құжатында бұл шектеу егжей-тегжейлі қарастырылған.

Үлгі алынғаннан бері өткен уақыт, сақтау температурасы, соңғы түсті көзбен бағалаудың субъективтілігі, гематокрит және реагент сапасы осы биологиялық әсерлерге қосымша аналитикалық ауытқулар енгізеді.

Скрининг диагноз қоюмен бірдей емес

Тапшылықты көрсететін, аралық немесе клиникалық көрініске сәйкес келмейтін скрининг нәтижесі G6PD ферментінің сандық талдауын қажет етеді. ДДСҰ температурасы бақыланатын сандық спектрофотометрияны эталондық әдіс деп есептейді. Бұл талдауда эритроциттер гемолизатына глюкоза-6-фосфат пен NADP+ қосылып, түзілген NADPH 340 nm толқын ұзындығындағы жұтылудың артуы арқылы бақыланады. Өзгеріс жылдамдығы фермент белсенділігіне пропорционал және әдетте гемоглобиннің бір грамына шаққандағы бірліктермен нормаланады. Қазіргі клиникалық-зертханалық тәжірибе Mayo сынақтар каталогының G6PD белсенділігіне арналған бөлімінде жинақталған.

Нәтижені түсіндіруде зертхана валидациялаған референстік аралық қолданылады. Ол көбіне популяциядағы қалыпты белсенділікке қатысты белгіленеді: тапшылық әдетте 30 пайыздық шек маңында, ал аралық белсенділік одан жоғары деңгейде қарастырылады. ДДСҰ-ның G6PD сынақтарына арналған мақсатты өнім профильдері (2022) осы диагностикалық негізді сипаттайды. Егер жуырдағы гемолиз немесе қан құю фенотипті анықтауды сенімсіз етсе, эритроциттер популяциясы қайта тұрақтанғаннан кейін сынақты қайталаңыз. Молекулалық зерттеу қосымша ақпарат бере алады, бірақ ферментті өлшеудің орнын алмастырмайды.

Сақтау қажет шекара

Бұл талдаулардағы метилен көгі — ex vivo зертханалық реагент. Бұл факт метилен көгін пациентке енгізу қауіпсіздігі туралы мәселеден бөлек қарастырылуы керек; қауіпсіздік мәселесі метилен көгіне қарсы көрсетілімдер жөніндегі нұсқаулықта қамтылған. Биохимия бұл екеуін байланыстырады, өйткені препарат та NADPH-қа тәуелді тотықсыздануға сүйенеді. Алайда сынауықтағы бояғыш — қанға енгізілген доза емес. Бояғыштың басқа жағдайда бояу құралы ретінде қалай әрекет ететінін түсіну үшін метилен көгімен бояу қағидаттарын, ал оның химиялық тобы туралы білу үшін зертханадағы тотығу-тотықсыздану бояғыштарын қараңыз.

Скрининг тотықсыздандыру қабілеті сақталғандай көріне ме деген сұраққа жауап береді. Растаушы зерттеу ферменттің нақты қанша екенін анықтайды. Екінші сұраққа жауап беру талап етілмесе, бояғыш бірінші сұраққа жақсы қызмет етеді.