ДНҚ мен РНҚ-ны бояуға арналған метилен көгі: гельдерде және мембраналарда қолдану

Студент агарозалық гельде электрофорез жүргізіп, оны метилен көгімен бояйды да, айқын жолақ күтілген жерден ештеңе көрмейді. Көрші жұмыс орнында постдокторант сол көк бояғыш құтысымен Northern мембранасын бояп, үш минут ішінде анық рибосомалық жолақтар алады. Студент гельдегі тәжірибе сәтсіз болды деп тұжырымдайды. Бірақ гельдегі тәжірибе сәтсіз болған жоқ. Екі міндет әртүрлі еді, сондықтан бір бояғыш оларды әртүрлі сезімталдықпен, әртүрлі фонмен және кейінгі әрекеттерге қойылатын әртүрлі ережелермен шешеді.

ДНҚ мен РНҚ-ны метилен көгімен бояудың химиялық негізі ортақ, бірақ мақсаты бірдей емес. Гельде бояғыш кеуекті матрицаның ішінде қанша нуклеин қышқылы бар екенін көрсетеді. Мембранада ол тасымалдаудың сәтті өткенін және жолдарға үлгінің біркелкі енгізілгенін көрсетеді. Осы айырмашылық түсінікті болғанда, хаттамалар, анықтау шектері және үйлесімділік шектеулері де айқындалады.

Қысқаша жауап

Метилен көгі — нуклеин қышқылдарымен ковалентті емес әрі қайтымды байланысатын жазық катиондық бояғыш. Байланысу фосфатқа электростатикалық тартылу, негіз жұптарының арасына интеркаляциялану және кіші жүлгемен байланысу тетіктерінің үйлесімі арқылы жүреді. Негізгі ерекшелігі — осы қайтымдылық. Жолақтарды бояп, көрінетін жарықта тіркеуге, содан кейін клондау, гибридтеу немесе зондпен қайта тексеру үшін бояуын кетіруге не тазартуға болады.

Қос тізбекті ДНҚ-ны агарозалық гельде метилен көгімен бояудың стандартты жылдам құрамы — судағы 0.02 пайыз w/v (200 микрограмм/mL). Бояу шамамен 15 минут, ал сумен бояуды кетіру тағы шамамен 15 минут жүреді; нәтижені ақ жарық қорабында қарайды. Мембраналарға арналған классикалық Northern-блот құрамы — pH 5.2 шамасындағы натрий ацетатында 0.02–0.04 пайыз бояғыш. Тасымалдау мен бекітуден кейін бірнеше минут бояп, сумен шаяды және гибридтеу алдында бояуды толық кетіреді. Сезімталдығы орташа: жақсы жағдайда гельдегі бір жолаққа ондағаннан жүздеген нанограммға дейін, ал сақтықпен берілген нұсқаулықтарда 0.5–1 микрограмм көрсетіледі. Бұл этидий бромиді мен SYBR бояғыштарының анықтау шектерінен бірнеше реттік шама жоғары. Мембраналарда жеке транскрипт үшін пайдалы бірыңғай анықтау шегі жоқ, өйткені бояғыш негізінен мол мөлшердегі рибосомалық РНҚ мен енгізілген материалдың жалпы көлемін көрсетеді. Екі құрамның ешқайсысына бөлшек саудада сатылатын қоспа ерітіндісін алмастырып қолданбаңыз. Тексерілген әдістер аналитикалық сападағы бояғышты, құрамы нақты буферлерді және РНҚ-мен жұмыс істегенде RNase жоқ жағдайды көздейді.

Байланысу қалай жүреді және қай жерде жаңылыстырады

Пайдалы модель үш бөліктен тұрады. Біріншіден, оң зарядталған сақиналық жүйе теріс зарядталған фосфат қаңқасына тартылады. Спектроскопиялық зерттеулер тұз мөлшері төмен кезде осы электростатикалық құрамдастың басым екенін көрсетеді, ал модельдеу мен молекулалық динамика қос тізбекті ДНҚ үшін интеркаляция мен кіші жүлгеге байланысуды тұрақты режимдер ретінде қарастырады. Бұл метилен көгінің ДНҚ-мен байланысуын спектроскопиялық зерттеуде қорытындыланған. Екіншіден, GC-ге белгілі бір басымдық бар: модельдеу CpG және GpC қадамдарын қолайлы деп көрсетеді, ал тәжірибелер метилен көгінің интеркаляциялық басымдықтары туралы жұмыста GC-ге бай дуплекстермен басым байланысуын хабарлайды. Алайда AT дуплекстері де байланысады. Қалыпты бояу нуклеотидтік реттілікке тән емес. Үшіншіден, бір тізбекті ДНҚ мен РНҚ негізінен электростатикалық әрекеттесу және қолжетімді негіздермен әрі дуплекстік аймақтармен стекинг арқылы байланысады. Сондықтан боялу қарқындылығы ұзындыққа, реттілікке және екіншілік құрылымға қарай өзгереді.

Бұдан екі салдар шығады. Байланысу ковалентті емес болғандықтан, бояғыш жуылып кетеді. Полиакриламидтегі жолақтар арнайы бекітілмесе, тез солады. Қалыпты бояу уақытша болғандықтан, тұрақты бекітуге арналған арнайы нұсқа жасалған; оны Soto және Draper PAGE гельдері үшін сипаттаған. Бояғыш фотосенсибилизатор болғандықтан, боялған ДНҚ-ны оттегі бар ортада ұзақ уақыт қарқынды жарықтандыру гуанинді тотықтырып, ақырында тізбектерде үзілістер туғызуы мүмкін. Бұл тетік метилен көгі сенсибилизациялаған гуанин тотығуы туралы жұмыста егжей-тегжейлі берілген. Ақ жарықта қысқа уақыт қарау этидий бромидін қолданатын классикалық жұмыс тәртібіндегі белгілі ультракүлгін зақымдануды болдырмайды, әрі бұл препаративтік бөліп алу үшін нақты артықшылық. Көрінетін жарық жұмсағырақ әсер етеді, бірақ зиянсыз емес. ДНҚ клондауға пайдаланылатын болса, жарықтандыру уақытын қысқа ұстаңыз. Осы сақтықтың кеңірек фотохимиялық негізі туралы метилен көгі фотохимиясының екі жолын қараңыз. Тотыққан түрдің неге байланысатынын, ал тотықсызданған түрдің неге байланыспайтынын түсіндіретін тотығу-тотықсыздану жұбы мен заряд күйлері туралы метилен көгінің құрылымы мен қасиеттерінің химиясын қараңыз.

Бірінші міндет: гель ішінде бояу

Гельді бояу бір сұраққа жауап береді: бұл жолақта көзбен көруге жеткілікті нуклеин қышқылы бар ма? Агарозадағы қос тізбекті ДНҚ — ең жақсы сипатталған жағдай. Flores және әріптестерінің метилен көгімен гельді бояудың бастапқы әдісі 1 пайыз агарозадағы 0.02 пайыздық жылдам хаттаманы тексеріп, кейін ДНҚ-ны сәтті бөліп алуға және клондауға болатынын көрсетті. Сол жеткізуші хаттамасы IBI Scientific метилен көгі өнімінің бетінде де берілген; онда мембранаға арналған 0.04 пайыздық құрам мен гельге арналған жылдам нұсқа қатар көрсетілген.

Практикалық жұмыс тәртібі:

1. Гельде электрофорезді әдеттегідей жүргізіңіз. Өзгертілген әдіс үшін тасымалдау немесе ажырату қабілеті тексерілмесе, электрофорез кезінде емес, одан кейін бояңыз.
2. Гельді дистилденген судағы 0.02 пайыз w/v метилен көгіне батырып, жайлап шайқай отырып шамамен 15 минут ұстаңыз.
3. Матрица фоны азайып, жолақтар айқындалғанша суды бірнеше рет ауыстырып, жалпы шамамен 15 минут бояуды кетіріңіз.
4. Ақ жарықпен жарықтандырғышта дереу суретке түсіріңіз.

Агароза мен полиакриламидтің қасиеттері әртүрлі. Агароза бояғышты матрицада ұстап қалады, сондықтан бояуды кетіру баяу жүреді. Жұқа полиакриламид гельдері тез боялады, бірақ бояғышты да тез жоғалтады. Бұл препаративтік кесіп алуға көмектескенімен, мұрағаттық тіркеуге қолайсыз. Полиакриламидтегі синтетикалық олигонуклеотидтердің орнын қалыптасқан Current Protocols үлгісіндегі PAGE әдістеріне сай, сол 0.02 пайыздық құраммен және сумен бірнеше рет шаю арқылы 20–30 минутта анықтауға болады. Препаративтік олигонуклеотидтер үшін сұйылтылған TBE-дегі шамамен 0.0002 пайыздық өте сұйық нұсқалар бірнеше сағат бойы қолданылғаны хабарланған, бірақ олардың дәлелдік негізі әлсіздеу.

ДНҚ мен РНҚ арасындағы айырмашылық маңызды. Қос тізбекті ДНҚ құрылымға тәуелді ең күшті байланысуды береді. РНҚ мен бір тізбекті ДНҚ да боялады, бірақ әлсіздеу және нәтижесін болжау қиынырақ. Формальдегидті агарозалық РНҚ гельдерімен жұмыс істегенде, зертханалардың көбі гель ішінде көк бояғышпен боямай, алдымен РНҚ-ны мембранаға тасымалдайды да, содан кейін сол жерде бояйды. Осылайша әлсіз гельдік сигналдың орнына айқынырақ мембраналық сигнал және үлгі енгізілуінің тіркелген көрінісі алынады.

Екінші міндет: мембраналарда бояу

Мембрананы бояу басқа сұраққа жауап береді: тасымалдау сәтті өтті ме және жолдарды салыстыруға бола ма? Классикалық қолданылуы — Herrin және Schmidt ұсынған қайтымды Northern-блот бояуы. Бастапқы әдісте pH 5.0 кезіндегі 50 mM натрий ацетатында 0.04 пайыз бояғышпен 2–3 минут бояп, сумен шайған; гибридтеу алдында бояғышты SSPE-дегі сұйылтылған SDS көмегімен кетіруге болған.

Кең қолданылатын қазіргі нұсқаның тәртібі мынадай:

1. РНҚ-ны немесе денатурацияланған ДНҚ-ны нейлонға не нитроцеллюлозаға тасымалдаңыз, содан кейін бояу кезінде үлгі жоғалмауы үшін ультракүлгін сәулемен айқастыра байланыстырып немесе қыздырып бекітіңіз.
2. Міндетті емес, бірақ жиі қолданылатын қадам: мембрананы 5 пайыз сірке қышқылында шамамен 15 минут сулаңыз.
3. pH 5.2 шамасындағы 0.3–0.5 M натрий ацетатында 0.02–0.04 пайыз метилен көгімен 5–10 минут бояңыз.
4. Сумен шайып, 5–15 минут бояуды кетіріңіз, нәтижені тіркеңіз, содан кейін гибридтеу алдында қалған бояғышты алып тастаңыз.

Northern жұмыстарында оң зарядталған нейлон басым қолданылады. Нитроцеллюлоза да сірке қышқылы мен ацетат қолданылатын сол жұмыс тәртібімен жарайды. Кескін тасымалдауды растау, 28S және 18S жолақтарын (немесе бактериялық РНҚ үшін 23S және 16S жолақтарын) салыстыру, өлшем маркерлері мен стандарттарды белгілеу және жалпы РНҚ бойынша шамамен нормалауды тіркеу үшін пайдаланылады. Жарияланған Northern әдістерінде енгізілген үлгі мөлшерін тексеру үшін боялған рибосомалық жолақтар сандық бағаланады. Бұған нормалау үшін метилен көгімен боялған рибосомалық жолақтарды қолданған сүт ғылымы саласындағы жұмыс та жатады. Southern мембраналарын да осылай көрнекілеуге болады, бірақ бұл бояғыш Northern әдісінде үлгі енгізілуі мен тасымалдауды тексеру құралы ретінде әлдеқайда жақсы орныққан. Ал Southern ДНҚ-сы тасымалдауға дейін денатурацияланатындықтан, гельге арналған сезімталдық көрсеткіштерін оған қолдануға болмайды.

Анықтау шектері мен фон: көк бояғыш қай жерде ұтылады

Төмендегі салыстыру әдейі жуық түрде берілген. Бояғыштың нәтижелілігі гель пайызына, жолақ еніне, оптикаға және бояуды кетіру тәртібінің сақталуына байланысты. Әр санды нақты сипаттама емес, шаманың реттік бағасы деп қабылдаңыз.

Орташа сигналды қолдануға жарамды ету фонды бақылауға байланысты. Бос бояғыштың түсі өте қанық, сондықтан контраст байланысқан бояғышты кетірмей, байланыспаған бояғышты алып тастау арқылы алынады. Бояғыш концентрациясын арттыру сезімталдықты сирек жоғарылатады. Негізінен бояуды кетіру уақытын ұзартады. Нақты қолданылатын гельде, мембранада және камерамен сұйылтулар қатарын тексеріп, тек интегралдық тығыздық енгізілген мөлшерге пропорционал болып қалатын аралықты пайдаланыңыз. Метилен көгі енгізілген үлгі мөлшерін жартылай сандық нормалауға мүмкіндік береді. Ол кең динамикалық диапазоны бар сандық талдау емес, өйткені мембрана сыйымдылығы, тасымалдау тиімділігі, қанығу және бояуды кетіру жолдан жолға өзгереді.

Үйлесімділік шектеулері: бояудан кейін нені жасауға болады

Көк бояғышпен бояудан кейін клондау мүмкіндігі көрсетілген. Flores және әріптестері боялған агарозалық жолақтарды кесіп алып, ДНҚ-ны бөліп алған, оны лигирлеп, трансформация жүргізген. Олар этидий бромиді мен ультракүлгін сәулені қолданғаннан кейінгіге қарағанда клондау нәтижесі жақсырақ болғанын хабарлаған. Ықтимал себеп — бояғыштың өз пайдасы емес, фотозақымданудың аз болуы. Ақ жарық әсерін қысқа ұстаңыз және бөліп алынған ДНҚ-ны гельден экстракциялаудың қалыпты тазарту кезеңінен өткізіңіз.

ПТР мен секвенирлеуге қатысты дәлелдер аздау. Қалдық бояғыш нуклеин қышқылдарымен байланысады, сондықтан ферменттік кезеңдерге дейін бояуды кетіріп, тазарту жүргізіңіз. Көк бояғышпен боялған гельден тиісінше тазартылған ДНҚ жұмысқа жарамды болады деп күтіледі, бірақ әртүрлі полимеразалар мен секвенирлеу химияларының бояғыш қалдығына төзімділігі сандық тұрғыдан жеткілікті бағаланбаған. Оны өздігінен жарамды деп есептемеңіз.

Блотты гибридтеу мына тәртіп қатаң сақталғанда үйлесімді: тасымалдау, бекіту, бояу, тіркеу, бояуды кетіру, гибридтеу. Бұл тізбек — Herrin және Schmidt әдісінің негізі. Тасымалдауға дейін бояу немесе бояуды кетіруді өткізіп жіберу — басқа әдіс, оны бөлек тексеру қажет. Бояғыш алынғаннан кейін зондты стандартты жолмен алып тастау және зондпен қайта тексеру қалыпты тәртіппен жүргізіледі. Сол бояғыштар тобы арқылы жасуша деңгейінде бояу және бекітілген жұғындыға арналған тәсілді неге тірі жасуша әдістеріне қолдануға болмайтыны туралы микроскопиялық бояу атласын қараңыз.

Тұрақты бекіту нұсқасы қолданылмаса, жолақтарды кесіп алу препаративтік агароза үшін де, көк бояғышпен орны анықталған PAGE олигонуклеотидтері үшін де жарайды. Қайтымды байланысатын бояғыш жағдайында бояуды кетіргеннен кейін электроэлюция жүргізу химиялық тұрғыдан қисынды, бірақ метилен көгіне тән шығым бойынша бақыланатын деректер аз. Элюциядан кейін тұзсыздандырыңыз немесе тұндырыңыз.

Қайталанатын ақаулар

Гельдегі көмескі жолақтар әдетте колориметриялық бояуға қажетті массаның аздығын білдіреді, әсіресе қысқа бір тізбекті немесе РНҚ нысаналары үшін. Үлгіні көбірек енгізіңіз, жаңа бояғыш қолданыңыз, концентрацияны арттырмас бұрын бояу уақытын ұзартыңыз және бояуды кетіруді ертерек тоқтатыңыз. Контрастсыз тұтас көк гель әдетте шамадан тыс бояуды немесе судың тым аз ауыстырылғанын білдіреді. PAGE жолақтарының солуы — бояудың сәтсіздігі емес, күтілетін химиялық құбылыс. Тез суретке түсіріңіз. Мембрана фонының біркелкі болмауы қатпарларды, көпіршіктерді, саусақ іздерін, біркелкі шайқалмауды немесе ала-құла тасымалдауды көрсетуі мүмкін. Гибридтеу бақылауы болмаса, мұны үлгінің әркелкі енгізілуі деп түсіндірмеңіз. Жайылған әлсіз рибосомалық көрініс деградацияны білдіруі мүмкін, бірақ оған толық емес тасымалдау, жалпы РНҚ мөлшерінің аздығы (әдетте жолдарға бірнеше микрограмнан ондаған микрограмға дейін енгізіледі) немесе бояуды шамадан тыс кетіру де себеп болуы мүмкін. Бояғыш мол мөлшердегі рибосомалық РНҚ-ны көрсетеді. Ол нақты бір транскриптті көрсетпейді. Бұл міндетті зонд атқарады.

Артық тұжырымсыз қауіпсіздік және жұмыс істеу

Метилен көгімен жұмыс істеу этидий бромидіне қарағанда қарапайымырақ, бірақ ол зиянсыз емес. Қолданыстағы MilliporeSigma қауіпсіздік деректер парағы бояғышты жұтқан кездегі жедел уыттылықтың 4-санатына жатқызады: жұтылса зиянды. Sigma-Aldrich метилен көгінің SDS құжатына сай, оны бекітілген қалдықтарды жою тәртібі арқылы кәдеге жарату керек. Этидий бромидіне қатысты геноуыттылық ескертулері қатаңырақ, соның ішінде оның Sigma-Aldrich этидий бромидінің SDS құжатында жыныс жасушаларына ықтимал әсері көрсетілген. Thermo Fisher нуклеин қышқылдары бояғыштарына арналған нұсқаулықта айтылғандай, оның гельдері мен ерітінділері әдетте қауіпті химиялық қалдық ретінде бөлек жиналады. Екеуі үшін де SDS пен мекеме ережелерін сақтаңыз. Құрғақ бояғышты тығыз жабылған күйде әрі құрғақ жерде ұстаңыз, жұмыс бояғышын тек хаттама рұқсат еткенде қайта қолданыңыз, боялған мембраналарды сүзгі қағазы парақтарының арасында құрғақ күйде сақтаңыз және гельдерді жолақтар диффузиядан жайылып кетпей тұрып суретке түсіріңіз.

Зертханалық жұмысқа арналған қысқа тұжырымды есте сақтаңыз. Гельдер ақ жарықта үлгінің көп мөлшерінің көрінетінін тексереді. Мембраналар зонд сезімтал анықтауды атқарғанға дейін тасымалдау мен үлгі енгізілуін тексереді. Бір бояғыш екі міндетке де жарайды, бірақ оның сезімталдығы орташа, байланысуы қайтымды және әрекеттер реті қатаң сақталуы тиіс.