Мақала
Данио-рерио зерттеулеріндегі метилен көгі: күтіп-ұстауға арналған қоспа және эксперимент нәтижелерін шатастыратын фактор
Данио-рерио уылдырығының суы көбіне әлсіз көк түсті болады, ал мұның себебін ешкім дерлік жазып көрсетпейді. Бұл бояғыш — зеңге қарсы қосылатын метилен көгі, ал хаттамалардың көбі оны жай ғана фондық жағдай деп қарастырады. Мұнда фон деген ұғым дұрыс емес. Дәлірек ұғым — есепке алынбаған эксперименттік фактор: әсерге ұшыратылған үлгілер бар ыдыстарда болатын, ал бақылау үлгілерінде болмайтын, қолданылатын концентрацияларда фармакологиялық белсенді және эксперимент өлшейтін көрсеткіштердің өзін өзгерте алатын зат.
Төмендегі талқылаудың бәрі осы айырмашылыққа негізделген. Зеңге қарсы қалыпты күтіп-ұстау тәжірибесі — бір мәселе. Қоспаның сіздің талдауыңызға қатысты бейтарап болуы — мүлде басқа мәселе. Данио-рерио жөніндегі соңғы әдебиет бірінші сұраққа көңілге қонымды, ал екіншісіне алаңдатарлық жауап береді.
Нұсқаулықтар іс жүзінде не ұсынады
Бірыңғай стандарт жоқ, мәселенің бір бөлігі де осында. Canadian Council on Animal Care нұсқаулығы зеңнің өсуін азайту үшін уылдырық пен дернәсілдерді тасымалдауға арналған ерітіндіде 0.5 mg/L, яғни 0.00005% қолдануға рұқсат береді. Зертханалық жануарларға арналған еуропалық нұсқаулықта эмбриондардың көбіне дәл сол 0.00005% бар ортада ұсталатыны сипатталған. Cold Spring Harbor ұсынған E3 рецепті қоспа ретінде бұдан екі есе көп мөлшерді, 1 mg/L немесе 0.0001% көрсетеді. Бұған қарама-қайшы келетін елеулі жайт бар: OECD балық эмбриондарының уыттылығын тексеру нұсқаулығында қайта дайындалған сұйылту суы мен сыналатын химиялық зат көрсетілгенімен, оның 2013 жылғы нұсқасында да, кейінгі редакциясында да метилен көгі ұсынылмайды. Сөйтіп, бір зертхана данио-рерио эмбриондарын тіршілігінің алғашқы сағаттарынан бастап метилен көгі қосылған көк суда өсіреді, ал екіншісі нормативтік эмбрион сынағын мөлдір суда жүргізеді; екеуі де өз ортасын қалыпты деп атайды. Зертханалар арасындағы нәтижелерді салыстыратын немесе бұрынғы бақылау деректерін біріктіретін кез келген адам осы сәйкессіздікпен бетпе-бет келеді.
Концентрацияларды түсіну үшін: 0.00005% шамамен 1.56 микромолярға, ал 0.0001% шамамен 3.13 микромолярға тең. Бұл сандар аз, сондықтан оларды әсер етуге тым төмен деп қабылдау оңай. Төмендегі зерттеулер дәл осы болжамды дәл осы концентрацияларда тексереді.
Зертханалық тәжірибеден емес, аквариум балықтарын ұстау саласынан келген оқырмандар осы молекуламен басқа жағдайда танысады; ол метилен көгі туралы аквариум нұсқаулығында қарастырылған. Химиялық негізі ортақ; бояғыштың жасушаларда электрондарды қалай тасымалдайтыны туралы түсіндірме тотығу-тотықсыздану белсенділігі бар қосылыстың метаболизм жөніндегі еңбектерде неліктен жиі кездесетінін көрсетеді. Бұдан кейінгі талқылау метилен көгі қосылған данио-рерио уылдырығының суына ғана қатысты.
Метаболизм: әсердің бағыты даму кезеңіне қарай өзгереді
Ең көп мәлімет беретін зерттеуде қалыпты дамып келе жатқан данио-рерио тіршілігінің бірінші күнінен ұрықтанудан кейінгі 5 күнге дейін әсерге ұшыратылып, әр кезеңдегі тотығу метаболизмі өлшенген. Бұл эмбрион метаболизмі тәжірибелерінің жарияланған есебінде сипатталған. Әсердің бағыты кері ауысатындықтан, бұл заңдылықты мұқият баяндау қажет.
Ұрықтанудан кейінгі 1 күнде әсерге ұшыраған эмбриондардың базалық оттегі тұтынуы күтіп-ұстауда қолданылатын екі концентрацияда да артқан. 2 күнде дернәсілдердің беткі қабатындағы митохондриялық мембрана потенциалы 0.00005%, 0.0001% және 0.0003% әсер ету жағдайларының бәрінде жоғарылаған. 4–5 күнге қарай, уылдырықтан шыққаннан кейін, әсердің бағыты өзгерген: тотығуға байланысты энергия шығыны азайған. Бұл әсер ұрықтанудан бері үздіксіз жүргізілсе де, тек 3 күннен 4 күнге дейін қысқа мерзімді болса да байқалған. Сонымен қатар, митохондриялық тыныс алу кешендерінің суббірліктеріне сәйкес транскрипттер 1 және 4 күнде де азайған; стероидогенез бен глюконеогенезге байланысты транскрипттер де төмендеген.
Тағы екі байқау көріністі нақтылай түседі. Күтіп-ұстауда қолданылатын жоғарырақ концентрацияда уылдырықтан шығу сәл ертерек жүрген: 2 күнде әсерге ұшыраған эмбриондар алда болған, ал 3 күнге қарай бақылау тобы оларды қуып жеткен. Стреске жауап беру осінің өзі сақталғандай көрінген: 5 күндік дернәсілдерге суды айналдыра қозғау арқылы стресс тудыратын әсер жасалғанда, бүкіл денедегі кортизол деңгейі екі топта да қалыпты артқан. Демек, осы мөлшерлерде бояғыш дамуға жалпы уытты әсер ететін зат емес және барлық физиологиялық жауапты бірдей бәсеңдетпейді. Ол энергия метаболизмін даму кезеңіне қарай өзгертеді: уылдырықтан шығуға дейін арттырып, одан кейін төмендетеді.
Мінез-құлық: екі зерттеу неге келіспейді және екеуі де қалай дұрыс болуы мүмкін
Әсер ету сызбаларын қатар қойып қарастырғанға дейін мінез-құлық туралы әдебиет қарама-қайшы көрінеді. Бір даму мен мінез-құлық қауіпсіздігін зерттеу эмбриондарға ұрықтанудан кейін шамамен 6 сағаттан бастап 10 микромолярға дейінгі концентрациялармен әсер еткен. Ерітінділер 4 күнге дейін күн сайын жаңартылған, содан кейін дернәсілдер 5 және 6 күндері бояғышсыз ортаға көшіріліп, 6 күні жарық-қараңғы сынағында қозғалыс белсенділігі тексерілген. Нәтижесінде өлім-жітімге, уылдырықтан шығуға немесе морфологияға елеулі әсер де, өңдеудің қозғалыс белсенділігіне әсері де анықталмаған. Авторлар өз жағдайлары үшін 10 микромолярды жоғарғы шек ретінде негізді түрде ұсынған.
Метаболизм зерттеуінің авторларымен ішінара ортақ екінші топ әсерді күтіп-ұстау тәжірибесіне сай жүргізген: бояғыш ұрықтанудан кейінгі 2–3 сағаттан бастап ортада болған, орта күн сайын ішінара жаңартылған, ал мінез-құлық әсер жалғасып жатқанда немесе одан көп ұзамай өлшенген. Дәл сол қалыпты концентрацияларда дернәсілдердің 24 сағаттық сынақтағы қозғалыс белсенділігі төмендеген; бұл нәтиже әртүрлі линиялар мен зертханаларда қайталанған. Мінез-құлық нәтижелерін шатастыруды зерттеген жұмыс әсердің серотонинергиялық тонуспен байланысын көрсеткен, бұл бояғыштың белгілі моноаминоксидазаны тежеу қасиетіне сәйкес келеді. Ең маңыздысы — метилен көгі бар эмбрион ортасы SSRI флуоксетиніне күтілетін қозғалыс жауабын бүркемелеген. Сондықтан көк суда жүргізілген скринингтік сынақ мөлдір суда байқалатын дәрі әсерін анықтай алмай қалуы мүмкін.
Іс жүзінде қайшылық жоқ. Бір қосылыс бір сынақта шайып шығарылғаннан кейін екі күн өткенде анықталатын қалдық әсер қалдырмауы, бірақ басқа сынақта ортада тұрған кезінде белсенді болуы мүмкін. Практикалық қорытынды мынадай: әсер анықталмаған нәтиже бейтараптық туралы тұжырымды емес, концентрацияның жоғарғы шегін негіздейді. Ал әсер анықталған нәтиже маңызды тәуекелді сипаттайды: зертханалардың көбі қолданатын дәл сол жағдайда өлшеу кезеңінде белсенді әсердің болуы.
Тотығу-тотықсыздану сынағындағы тотығу-тотықсыздану бояғышы
Тағы бір тұзақты бөлек қарастыру қажет, өйткені ол жануарға емес, өлшеу құралына кедергі келтіреді. Alamar Blue энергия шығыны сынағының өзі тотығу-тотықсыздану химиясына негізделген: резазурин флуоресцентті резоруфинге дейін тотықсызданады. Метилен көгі де тотығу-тотықсыздану реакцияларына қатысады. Жасушасыз бақылау үлгілерінде күтіп-ұстауда қолданылатын екі концентрация да 24 сағаттан кейін Alamar Blue флуоресценциясын аздап, бірақ статистикалық мәнді түрде төмендеткен. Жануарлармен жүргізілген тәжірибелерде әсерге ұшыраған эмбриондар сынақ алдында бояғышсыз ортада кемінде үш рет жуылған, ал уылдырықтан шыққан дернәсілдердегі биологиялық әсер жасушасыз ортадағы кедергіден үлкен болған. Демек, екі тұжырым да дұрыс: жуылған жануарларда нақты метаболизмдік әсер сақталады, ал жуылмаған бояғыш оған тікелей химиялық артефакт қосады. Бақылау үлгілері осы екеуін ажыратуы керек, әйтпесе екі санның да мәні жоқ. Бояғышқа негізделген сынақ нәтижелерін түсіндіру жөніндегі жалпы нұсқаулық мұнда ерекше маңызды.
Даму кезеңдерінің уақыт кестесі
Осы мақалаға арнайы әзірленген материал. Өзгеше көрсетілмесе, концентрациялар күтіп-ұстауда қолданылатын екі стандартты мәнге, 0.00005% және 0.0001%-ға сәйкес келеді.
| Кезең | Не тексерілді | Күтіп-ұстауда қолданылатын концентрациялардағы нәтиже |
|---|---|---|
| 0-ден 1 dpf-ке дейін, уылдырықтан шықпаған эмбрион | Базалық оттегі тұтынуы, митохондриялық транскрипттер | Тұтыну артты; I және IV кешендерінің транскрипттері азайды |
| 2 dpf, уылдырықтан шығу кезеңі | Мембрана потенциалы; уылдырықтан шығу барысы | 0.00005%-дан 0.0003%-ға дейін потенциал артты; 0.0001% кезінде уылдырықтан шығу уақытша ертерек жүрді |
| 3-тен 4 dpf-ке дейін, уылдырықтан шыққаннан кейінгі қысқа мерзімді әсер | Тек 24 h әсерден кейінгі энергия шығыны | Шығын азайды, үздіксіз әсер нәтижесіне сәйкес келді |
| 4-тен 5 dpf-ке дейін, уылдырықтан шыққан дернәсілдер | Энергия шығыны; митохондриялық транскрипттер | Шығын 24 және 48 h кезінде азайды; I, II, III кешендері мен ATP синтазасының транскрипттері азайды |
| 5-тен 6 dpf-ке дейін, дернәсілдердің мінез-құлқы | 24 сағаттық қозғалыс белсенділігі; флуоксетинге жауап | Қозғалыс белсенділігі төмендеді; SSRI жауабы бүркемеленді |
| 2 күндік шайып шығару кезеңінен кейінгі 6 dpf | Жарық-қараңғы жағдайындағы қозғалыс белсенділігі; морфология | 10 микромолярға дейін қалдық әсер анықталмады |
Есте сақтайтын заңдылық — метаболизм көрсеткіштері ерте кезеңде жоғарылап, кейін төмендейді; мінез-құлыққа әсер бояғыштың ықпалы жүріп жатқанда байқалады, ал оны ағзадан шығарғаннан кейін, мұны тексерген жалғыз сынақта, анықталмаған.
Бақылауды ұйымдастыруға арналған тексеру тізімі
Осы мақалаға арнайы әзірленген екінші материал. Метилен көгі қолданылатын данио-рерио хаттамалары экспериментпен ұштасқанда осы тізімді пайдаланыңыз.
- Бояғышты су емес, реагент ретінде көрсетіңіз. Концентрацияны пайызбен де, микромолярмен де, әсердің басталуы мен аяқталуын ұрықтанудан кейінгі сағаттармен немесе күндермен, ортаны жаңарту кестесін және әр өлшеуге дейінгі шайып шығару аралығын жазыңыз.
- Бақылау үлгілерін зерттеу сұрағына сай таңдаңыз. Сыналатын химиялық затты зерттеу үшін бояғышсыз бақылау үлгілері қажет; күтіп-ұстауды зерттеу үшін бояғышсыз және бояғышы бар топтарды салыстырып, зеңге қарсы нәтижені тіркеу керек, өйткені аталған екі зерттеудің ешқайсысы зеңге қарсы тиімділікті өлшемеген.
- Тотығу-тотықсыздану сынақтарының алдында жуыңыз, содан кейін тексеріңіз. Бояғышсыз ортада кемінде үш рет шайып, қатарынан бояғыш пен реагент қосылған жасушасыз бақылау үлгісін тексеріңіз, өйткені бояғыш Alamar Blue сигналын тікелей төмендетеді.
- Мінез-құлық пен моноамин көрсеткіштерін тәуекелі жоғары деп қарастырыңыз. Қозғалыс белсенділігін, селт ету реакциясын, мазасыздыққа ұқсас мінез-құлықты, антидепрессанттар мен MAO тежегіштерін зерттегенде өлшеу кезінде бояғышты қолданбау немесе оның нақты көрсеткішке қатысты бейтараптығын дәлелдеу керек; бір-екі күндік шайып шығару бір қозғалыс әсерін жойғанымен, бұл басқа зерттеу сызбалары үшін дәлелденбеген.
- Метаболизмдік және митохондриялық көрсеткіштерді әр кезеңде тәуекелі жоғары деп қарастырыңыз. Оттегі тұтынуы, энергия шығыны, мембрана потенциалы және тыныс алу тізбегінің транскрипттері күтіп-ұстауда қолданылатын концентрацияларда өзгереді; уылдырықтан шығуға дейінгі және кейінгі өзгерістердің бағыты қарама-қарсы.
- Бір зерттеу сызбасындағы бейтараптықты басқасына көшірмеңіз. Шайып шығарғаннан кейін әсердің анықталмауы жалғасып жатқан әсерге қатысты емес; морфологиялық әсердің анықталмауы метаболизмге немесе дәрімен өзара әрекеттесуге қатысты емес; бір линияда, температурада немесе сынақ ұзақтығында алынған нәтиже басқа жағдайларға жүрмейді.
- Ұстанған нұсқаулығыңызды және оның баламасын көрсетіңіз. CCAC, еуропалық немесе Cold Spring Harbor концентрацияларын нақты атаңыз және OECD эмбрион сынағында бояғыштың көрсетілмейтінін атап өтіңіз, сонда оқырман сіздің жануарларыңыздың қандай жағдайда ұсталғанын түсіне алады.
Мұның ешқайсысы уылдырықты тірі сақтау үшін бояғышты қолдануға қарсы дәлел емес. Бұл — күтіп-ұстаудағы таңдаудың тексерілместен деректерге ықпал етуіне қарсы дәлел. Ыдыстағы көк түс — фармакологиялық қасиеттері бар молекула; ал бұрмалануға ең бейім тәжірибелер — қазір жас данио-рерио жиі қолданылатын, өткізу қабілеті жоғары метаболизмдік және нейромінез-құлықтық скринингтер. Оны тіркеңіз, бақылауға алыңыз, өлшеу алдында шайып шығарыңыз және оның байқатпай қатысуы мүмкін сынақты тексеріңіз.