Метилен көгі биоқабықшаларға қарсы: жарықпен белсендірілетін зертханалық зерттеулер нені өлшейді

Биоқабықша — сұйықтықта қалқып жүрген жасушалар жиынтығы емес. Ол — құрылым: бетке бекінген жасушалар өздері түзген полисахаридтер, ақуыздар және жасушадан тыс ДНҚ матрицасына енеді, ал сыртқы қабаттан ішкі қабатқа қарай оттегі мен қоректік заттардың мөлшері біртіндеп өзгереді. Суспензиядағы бактерияларды бірнеше минутта жоятын қосылыстың дәл сол микроорганизмдер биоқабықша түрінде өскенде әсер етпеуінің себебі — осы құрылым. Метилен көгі мен биоқабықшалар туралы кез келген тұжырымды осы құрылымды ескеріп оқу керек, өйткені жасушаларға қанша бояғыш, ал бояғышқа қанша жарық жететінін матрица анықтайды.

Бұл шолуда дәл үш дереккөз қарастырылады. Біреуі жалпы түсінік береді. Екеуі — зертханалық тәжірибелер. Олардың рөлдерін ажырату — осы тәсілдің негізі. Бұл осы тақырыптағы ең жиі кездесетін қателіктен, яғни зертханалық ыдыста алынған нәтижені адамдағы инфекцияны емдеудің дәлелі ретінде келтіруден сақтайды.

Жалпы түсінік беретін дереккөз жою туралы емес, химия туралы

Үшеуінің ішіндегі ең ескісі — 2005 жылы жарияланған фенотиазиний фотосенсибилизаторларын әзірлеу туралы баяндау шолуы. Ол метилен көгінің 19 ғасырдағы бояғыштан қатерлі ісіктің фотодинамикалық терапиясына, кейін фотодинамикалық микробқа қарсы химиотерапияға арналған жетекші қосылысқа дейінгі жолын сипаттайды. Оның негізгі үлесі — құрылым мен белсенділік арасындағы байланысты түсіндіру: хромофорды метилдеу липофильділікті, синглетті оттегінің шығымын және жарық әсеріндегі бактерицидтік белсенділікті арттырып, белсенділігі төмен лейкоформаға дейін тотықсыздануды баяулатады. Шолуда осы саланың мәселесі де ашық көрсетілген. Жұмыстардың көпшілігінде стандартты коммерциялық бояғыштар қолданылған, ал олардың туындыларын әзірлеуге салыстырмалы түрде аз көңіл бөлінген.

Бұл шолуды түсінігіңіздегі механизм бөлімі үшін пайдаланыңыз: жарық бояғышты қоздырады, триплеттік күйдегі бояғыш оттегімен әрекеттесіп, II типті энергия тасымалы арқылы синглетті оттегін немесе I типті электрон тасымалы арқылы радикалдарды түзеді. Осындай көп факторлы әсер әдеттегі төзімділік механизмдерінің фотодинамикалық жоюға нашар бейімделетінін түсіндіреді. Оны логарифмдік азаюдың дәлелі ретінде келтірмеңіз. Ондай көрсеткіш бұл шолуда өлшенбеген. Осы механизмнің негізіндегі кеңірек фотохимиялық түсініктер фотодинамикалық терапия жөніндегі деректер жинағында берілген, ал белгілі бір шамның бұл процесті іске қоса алатынын анықтайтын толқын ұзындығы ережелері метилен көгінің қызыл жарықты қалай жұтатыны туралы мақалада қарастырылған.

Биоқабықшаға қатысты екі тәжірибе, нәтижені бағалаудың екі түрлі тәсілі

Екі тәжірибелік мақала да метилен көгінің ауыз қуысы биоқабықшаларына 660 nm толқын ұзындығындағы фотодинамикалық әсерін тексереді, ал қалған сипаттамаларының барлығы дерлік өзгеше. Микробтық қауымдастықтары, жасы, бояғыш құрамдары, жарық дозалары және ең бастысы, нәтижелік көрсеткіштері әртүрлі. Осы айырмашылық — мақаланың негізгі ойы әрі төмендегі арнайы салыстыру кестесінің өзегі.

Біріншісі — 2024 жылы жарияланған жетілген көптүрлі қызыл иек асты биоқабықшасын in vitro зерттеу. Отыз үш түр Calgary Biofilm Device құрылғысындағы полистирол істікшелерде бірге өсірілген. Қоректендіру анаэробты жағдайда жүргізіліп, 72 сағаттан кейін қоректік орта ауыстырылған, ал өсіру жоспарлы 7 күнге дейін жалғасқан. Өңдеуде 0.01 пайыздық бос метилен көгі және 660 nm қызыл LED қолданылған: сәулелену қарқындылығы шамамен 330 mW/шаршы cm, әсер ету ұзақтығы 5 минут, арақашықтығы 2 mm болған. Осы мәндерді көбейткенде шамамен 99 J/шаршы cm шығады. Зерттеу төрт тобы бар нақты факторлық дизайнға құрылған: өңделмеген бақылау, жарықсыз бояғыш, бояғышсыз жарық және бояғыш пен жарық бірге.

Екіншісі — 2021 жылы жарияланған ауыз қуысы биоқабықшасының бастапқы қоныстанушыларын in vitro зерттеу. Streptococcus тұқымдасының төрт түрі 1 пайыз сахарозасы бар 96 ұяшықты планшеттерде 24 сағат бойы бірге өсірілген. Фотосенсибилизатор ретінде 4.65 микромоляр концентрациядағы бета-циклодекстрин нанобөлшектерімен байланыстырылған метилен көгі қолданылған. Бұл жеткізу құрамы бояғышты биоқабықша тосқауылдары арқылы өткізуге арналған. Екі жарық көзі де 660 nm толқын ұзындығындағы қызыл жарық беріп, 90 секунд әсер еткен, бірақ дозалары айтарлықтай ерекшеленген: лазер тобында 320 J/шаршы cm, ал LED тобында 8.1 J/шаршы cm. Бақылау топтарына жарықсыз бояғыш, тек лазер, тек LED, теріс бақылау ретінде физиологиялық ерітінді және микробқа қарсы салыстыру эталоны ретінде 0.2 пайыз хлоргексидин кірген.

7 күндік, 33 түрден тұратын анаэробты қауымдастық пен бастапқы қоныстанушылардың 24 сағаттық, 4 түрден тұратын биоқабықшасы — әртүрлі өлшеу жүйелері. Төмендегі сандарды орташалауға болмайды.

Әр зерттеу нақты нені өлшеді

Жетілген биоқабықша зерттеуінде нәтижелік көрсеткіштер ретінде 485 nm кезінде оқылған TTC тотықсыздануы бойынша метаболизмдік белсенділік және 33 түрге арналған зондтармен шахмат тақтасы әдісіндегі ДНҚ–ДНҚ гибридизациясы арқылы бактериялар саны бағаланған. Анықтау шегі шамамен 10,000 жасуша болған. Тіршілікке қабілетті микроорганизмдерді егіп санау, кристалл күлгінмен биомассаны бағалау, тірі және өлі жасушаларды бейнелеу немесе қайта өсуді кейіннен бақылау жүргізілмеген. LED қолданылмаған топтармен салыстырғанда, тек LED метаболизмдік белсенділікті шамамен 50 пайызға, ал бояғыш пен LED бірге шамамен 55 пайызға төмендеткен. Тек бояғыш қолданылған топ статистикалық тұрғыдан өңделмеген бақылаумен бір топқа түскен. ДНҚ негізіндегі санақ бойынша тек бояғыш, тек LED және бояғыш пен LED бірге қолданылған топтардың барлығында көрсеткіш бақылаудан едәуір төмен болған, бірақ осы үш топ арасында статистикалық мәнді айырмашылық болмаған. Авторлар қорытындыны тікелей айтады: өңдеулер қалыптасып, бетке бекінген көпмикробты биоқабықшаны жоймаған; жетілген пародонттық биоқабықшаның құрылымын механикалық жолмен бұзу қажет, ал фотодинамика ең әрі кеткенде қосымша әдіс бола алады.

Бастапқы қоныстанушылар зерттеуінде нәтижелік көрсеткіш селективті қоректік орталарда өсіріліп алынған тіршілікке қабілетті микроорганизмдер саны болып, логарифмдік шкалада берілген. Жарықсыз бояғыш тобы физиологиялық ерітінді тобынан ерекшеленбеген. Фотоактивацияланған екі топта да — лазер мен қапталған бояғыш және LED пен қапталған бояғыш бірге қолданылғанда — тіршілікке қабілетті микроорганизмдер саны теріс бақылаумен салыстырғанда шамамен 4 log-қа дейін азайған. Бұл осы көрсеткіш бойынша 10,000 есе немесе 99.99 пайыз төмендеуді білдіреді. Екі топ та хлоргексидин тобынан статистикалық тұрғыдан ерекшеленбеген. Тек жарық пен тек қараңғы жағдайдағы мәндер жеке, сенімді логарифмдік сандар ретінде берілмеген. Сондықтан адал қорытынды — мақала қолдайтын тұжырым: фотоактивацияланған қапталған бояғыш азаюға әкелген, қараңғыдағы бояғыш мұндай әсер көрсетпеген, ал осы жас биоқабықша моделінде әсер мөлшері антисептик эталонымен сәйкес келген.

Екі мақалада да өңдеуден кейінгі қайта өсу, қалдық биомасса немесе матрица құрылымы өлшенбеген. CFU санының азаюы қалған матрица туралы ештеңе айтпайды. Метаболизмнің төмендеуі тірі қалған жасушалар туралы ештеңе айтпайды. ДНҚ бойынша санақ қай жасушалардың тірі екенін көрсете алмайды.

Өлшеу әдістері мен нәтижелік көрсеткіштерді салыстыру

Бұл кесте — осы мақаланың салыстыру құралы. Бір зерттеудің нені дәлелдейтінін көру үшін жолды көлденең оқыңыз, ал екі зерттеу де қандай сұрақтарға жауап бермейтінін көру үшін бағанды төмен қарай оқыңыз.

Үш айырмашылықты ерекше атап өту керек. Біріншіден, жетілген модельде тек жарық қолданылған топ метаболизмдік әсердің барлығын дерлік түсіндіреді, сондықтан 55 пайыздық көрсеткіш бояғыш арқылы жоюды білдірмейді. Екіншіден, жас модельде қараңғыдағы құрам әсерсіз болып, әсер тек жарықпен пайда болады — бұл фотоактивацияның белгісі. Үшіншіден, ДНҚ негізіндегі санақтың 80 пайызға төмендеуі математикалық тұрғыдан шамамен 0.7 log-қа тек айнымалы тіршілікке қабілетті микроорганизмдер саны болған жағдайда ғана сәйкес келер еді. Бірақ мұнда ол басқа көрсеткіш, сондықтан оны ешқашан логарифмдік жою көрсеткіші ретінде келтіруге болмайды. Тіс биоқабықшасына қатысты қосымша мәліметтер ауыз қуысы биоқабықшасы мен стоматологиялық зерттеулер туралы жинақта берілген, ал зерттеулердегі модельдерді, енгізу жолдарын және нәтижелік көрсеткіштерді ажыратудың жалпы тәсілі зертханалық әдістер нұсқаулығында егжей-тегжейлі түсіндірілген.

Неліктен биоқабықша зерттеулерін түсіндірудің өз ережелері болуы керек

Метилен көгінің биоқабықшаға әсері жөніндегі нәтиженің өз зертханалық планшетінен тыс мәні бар-жоғын төрт айнымалы анықтайды.

Бірінші орында — биоқабықшаның жасы мен матрицасы. Ескі биоқабықшалар қалыңырақ, айқаспалы байланыстары көбірек және бояғыштың енуіне қиынырақ болады. 2021 жылғы мақаланың авторлары бояғыштың енуін және ұйымдасқан биоқабықша арқылы жарықтың нашар таралуын негізгі шектеулер деп атайды. Циклодекстринге қаптау сияқты тасымалдау стратегиялары дәл осы шектеуді еңсеруге бағытталған. Сондықтан құрам ұсақ деталь емес, тәжірибелік айнымалы болып саналады.

Екінші орында — дозаны есептеу. Мұндағы энергетикалық экспозиция мәндері бірдей толқын ұзындығында 8.1-ден 320 J/шаршы cm-ге дейін, яғни қырық есеге жуық өзгереді. Ал сәулелену қарқындылығы 90 mW-тан бірнеше W/шаршы cm-ге дейін жетеді. Толқын ұзындығының бірдей болуы әсер етудің бірдей екенін білдірмейді. Екі зерттеудің ешқайсысында да доза тәуелділік қисығын анықтауға жеткілікті түрде жүйелі өзгертілмеген.

Үшінші орында — бақылау топтары. Қараңғыдағы бояғыш тобы жоқ зерттеу бояғыштың өз уыттылығын жоққа шығара алмайды, ал тек жарық тобы жоқ зерттеу әсерді фотоактивацияға жатқыза алмайды. Екі мақалада да осы екі бақылау бар, бұл — олардың артықшылығы. Жетілген биоқабықша туралы мақала тек жарық тобының неге маңызды екенін көрсетеді: онсыз метаболизмдік нәтиже бояғыштың әсері болып көрінер еді.

Төртінші орында — нәтижелік көрсеткіштер. Тіршілікке қабілеттілік, метаболизм, ДНҚ мөлшері, биомасса, құрылым және қайта өсу — алты бөлек тұжырым. Мұндағы бірде-бір мақала олардың екеуінен артығын өлшемейді. Әсіресе қайта өсу ешбірінде бағаланбаған, сондықтан әсердің сақталуы дәлелденген емес, өлшенбеген күйінде қалады.

Бұл зерттеулер инфекцияны емдеу туралы нені дәлелдемейді

Бұл модельдердің ешқайсысында қан айналымы, иммундық жасушалар, сілекей ағыны, қызыл иек сайы сұйықтығының жаңаруы немесе механикалық тазарту жоқ. Ұяшықтағы бояғыш концентрациясы адамға қандай да бір жолмен енгізілгеннен кейінгі тіндегі концентрацияға тең емес. Жас немесе тіпті жетілген зертханалық биоқабықшаға бір рет 5 минут не 90 секунд әсер ету емдеу курсы болып саналмайды. Жетілген биоқабықша зерттеуінің авторлары фотодинамиканы дербес толық жою әдісі емес, механикалық алып тастауға ықтимал қосымша ретінде қарастырып, осыны өздері де айтады.

Дұрыс қорытындының ауқымы тар әрі нақты. Фотоактивацияланған метилен көгі жетілген зертханалық ауыз қуысы қауымдастығын жоймай-ақ, оның метаболизмін және ДНҚ негізінде бағаланған санын төмендете алады. Бұл тәжірибе жағдайында метаболизмдік әсердің басым бөлігін жарықтың өзі береді. Циклодекстринмен тасымалданатын фотоактивацияланған бояғыш жас зертханалық стрептококк биоқабықшасындағы тіршілікке қабілетті микроорганизмдер санын бірнеше реттік шамаға азайтып, сол модельдегі хлоргексидинмен салыстыруға болатын деңгейге жеткізе алады. Осы бақылаулардың кез келгенін адамдағы инфекцияға қолдануға бола ма деген сұрақтың жауабы жеткізуге, жарықтың жетуіне, оттегіне, анатомияға және бұл тәжірибелер өлшеуге арналмаған клиникалық нәтижелік көрсеткіштерге байланысты.