Метилен көгімен ашытқыны сынау: тірі жасушаларды санау және тыныс алу уақытын өлшеу

Зертханалық үстелде екі түтік тұр. Екеуі де көк. Біріншісінде микроскоп астындағы көк жасушалар ашытқының өлі екенін білдіреді. Екіншісінде түтіктегі ерітіндінің көктен түссізге айналуы ашытқының тірі екенін және тыныс алып жатқанын білдіреді. Бояғыш бірдей, ал нәтижелердің мағынасы қарама-қарсы. Осы екі сынаманы шатастырсаңыз, барлық қорытынды керісінше шығады.

Мақала түгелдей осы айырмашылыққа арналған. Метилен көгі — тотығу-тотықсыздану бояғышы: тотыққан күйінде көк, ал тотықсызданған күйінде түссіз лейкометилен көгі болады. Тіршілікке қабілеттілікті санау осы химиялық қасиетті қысқа микроскопиялық бақылауда пайдаланады. Тыныс алу тәжірибесі оны бүкіл қоспадағы реакцияның уақытын өлшеу үшін қолданады. Әрқайсысына өз хаттамасы, өз бақылаулары және нәтижеге сын көзбен қарау қажет.

Тіршілікке қабілеттілікті санау: қысқа бояу, нәтижені дереу бағалау

Сыра қайнатуда қолданылатын хаттама — ең жақсы стандартталған нұсқа. 2% натрий цитратында 0.01% w/v метилен көгін дайындап, оны ашытқы суспензиясымен 1:1 қатынасында араластырыңыз және қоспаны алдын ала белгіленген қысқа уақыттан кейін қараңыз. Жарияланған уақыт аралықтары Brewing Science Institute анықтамалығындағы 1–2 минуттан зерттеу хаттамаларындағы шамамен 5 минутқа дейін өзгереді, ал OIV шарап микробиологиясы әдісі 10 минут ішінде қарауды талап етеді. Санауға арналған қоспадағы бояғыш концентрациясы шамамен 0.005% болады. Жетілдірілген Нойбауэр камерасын толтырып, шамамен 400x үлкейту кезінде қою көк жасушаларды тіршілікке қабілетсіз, ал боялмаған жасушаларды тіршілікке қабілетті деп жіктеңіз. OIV әдісінде ашық көк жасушалар тірі деп есептеледі; мұның өзі төменде талқыланатын субъективтілік мәселесін аңғартады.

Жасуша концентрациясы камераның геометриясы бойынша анықталады. Орталықтағы толық 1 mm шаршы саналғанда, mL-ге шаққандағы жасушалар саны N-нің сұйылту коэффициентіне және 10^4-ке көбейтіндісіне тең болады; мұндағы N — сол аумақтағы жасушалар саны. Бұл есептеу ASBC ашытқы әдістерінде берілген. Тіршілікке қабілеттілікті есептеу оңайырақ: боялмаған жасушалар санын жалпы жасушалар санына бөліп, 100-ге көбейтеді. FEMS сыра қайнатудағы әдістерді салыстыру зерттеуіне және OIV тәжірибесіне сәйкес, тіршілікке қабілеттілікті бағалау үшін шамамен 400 жасуша санаңыз. Шекаралық ережені тұрақты қолданыңыз: мысалы, тордың төменгі және сол жақ сызықтарындағы жасушаларды қосып, жоғарғы және оң жақ сызықтарындағы жасушаларды қоспаңыз.

Санауды бастамас бұрын бүршіктерді есептеу ережесін белгілеу қажет. Кең таралған ереже бойынша бүршік аналық жасуша мөлшерінің шамамен жартысына жеткенде жеке жасуша ретінде саналады, ал одан кіші болса, аналық жасушамен бірге есептеледі. Қандай ереже таңдалса да, оны әр шаршыда қолданыңыз және келесі адам дәл солай қайталай алуы үшін санау парағына жазыңыз.

Санау парағы (басып шығарыңыз)

Бұл парақ осы мақала үшін арнайы әзірленген. Оны дәптерге көшіріңіз немесе әр үлгі үшін бір данадан басып шығарыңыз.

Тіршілікке қабілеттілік (%) = 100 x боялмаған / (боялмаған + қою көк). mL-ге шаққандағы жалпы жасушалар саны = N x сұйылту коэффициенті x 10^4, мұндағы N камераның белгіленген аумағынан алынады. Нәтиженің жанына бояу аралығын жазыңыз, өйткені уақыты көрсетілмеген тіршілікке қабілеттілік мәнін қайта өндіру мүмкін емес.

Тіршілікке қабілеттілік көрсеткіштері неге өзгереді

Бірінші кедергі — уақыт, әрі ол екі бағытта әсер етеді. Метаболизмдік белсенді жасушалар бояғышты тотықсыздандырады, сондықтан нәтижені тым ерте бағалау кезінде тірі жасушалар бояғышты толық тотықсыздандырып үлгермей, қате түрде өлі деп жіктелуі мүмкін. Бірақ ұзақ әсер етудің өзі уытты болып, шынымен зақымданған көк жасушалар түзеді; осылайша бастапқыда тірі жасушалар өлі ретінде есептеледі. Сондықтан зертханалық оқу хаттамасы нәтижені 5 минут ішінде бағалауды талап етеді; бұл Висконсиннің ашытқыға арналған оқу хаттамасында көрсетілген. Сенімді тұжырым мынадай: метилен көгімен бағалау уақытқа тәуелді, сондықтан бір қысқа аралықты белгілеңіз және бір сериядағы барлық үлгі үшін оны тұрақты ұстаңыз.

Тіршілікке қабілеттілігі төмен үлгілерде екінші жүйелік ауытқу бар. Стандартталған әдіс тіршілікке қабілеттілік шамамен 80%-дан төмен болғанда метилен көгі шынайы мәнді асыра бағалауы мүмкін екенін ескертеді, өйткені бояғышты әлі де тотықсыздандыратын жасушалар көбею қабілетін міндетті түрде сақтамайды. Сыра қайнату әдебиетінде тіршілікке қабілеттілік едәуір төмендегенде дәл осындай сенімсіздік сипатталады. Метилен көгін жедел әрі жуық бағалау құралы ретінде қарастырыңыз; ал тіршілікке қабілеттілігі төмен дақылды қайта ашытуға қосу сияқты маңызды шешімдерді қоректік ортаға егіп санау немесе қосымша бояу әдісімен растаңыз.

Үшінші кезекте — матрица әсерлері. OIV әдісі шамамен pH 4.6 жағдайында орындалады және pH төмен, буферлік сыйымдылығы жоғары үлгілер бояғыштың дұрыс әрекет етуіне кедергі келтіретінін ескертеді. Сондай-ақ қант мөлшері 100 g/L-ден жоғары болғанда бұл сынаманы қолданбауға кеңес береді: мұндай жағдайда жасушалар жаңылыстыратын ашық көк түспен көрінеді. Бояу кезіндегі pH-ты тәжірибелік салыстыру сыналған аралықта сезімталдықтың айтарлықтай өзгеретінін көрсетті; бұл метилен көгі әдісінің pH-қа тәуелділігін зерттеумен сәйкес келеді. Қалдықтар — бөлек қате көзі: ластанған ашыту қоспаларындағы боялған бөлшектер өлі жасушаларға ұқсап, операторлар арасындағы нәтижелер айырмасын арттырады.

Бұл айырмашылық жай бақылау емес, санмен бағаланған. FEMS ашытқы әдістерін салыстыруында сипатталған алты айлық сыра қайнату сынағында метилен көгімен қайталанған өлшеулердің стандартты ауытқуы орта есеппен 6.1% болды, ал оксонолмен ағындық цитометрияда ол 0.2% құрады. Бір үлгі бойынша екі оператордың нәтижелері 13 пайыздық тармаққа дейін ерекшеленді. Тіршілікке қабілеттілікті бағалау әдістерінің 2023 жылғы сандық салыстыруы флуоресценттік микроскопия мен ағындық цитометрияның дәлдігі едәуір жоғары екенін анықтады, сонымен бірге әдіс нәтижелілігінің түрге және матрицаға тәуелді екенін көрсетті. Painting және Kirsop (PMID 24430080) ұсынған классикалық әдіс сипаттамасы негізгі бағдар болып қала береді, ал ашытқының тіршілікке қабілеттілігі мен физиологиялық белсенділігін бағалау сынамаларына арналған кеңірек шолу (PMID 25154541) метилен көгін түпкілікті емес, бірін-бірі толықтыратын сынақтар қатарына жатқызады. Мұнда трипан көгіне ауысу автоматты түрде жақсарту болып саналмайды: ол мембрана тұтастығының жоғалуын көрсетеді, ал метилен көгі жасушаға енуін және тотықсыздандыру белсенділігін көрсетеді. Сондықтан күйзеліске ұшыраған жасушалар осы екі бояғышпен әртүрлі жіктелуі мүмкін.

Тыныс алу тәжірибесі: көк түстің жойылу уақытын өлшеу

Екінші сынамада микроскоп мүлде қолданылмайды. Ашытқы, глюкоза және сұйылтылған метилен көгі жабық түтікке салынады, ал көк түстің жойылуына кететін уақыт өлшенеді. Жасушалар метаболизм барысында көк бояғышты түссіз түріне айналдыратын тотықсыздандырғыш эквиваленттер түзеді, ал еріген оттегі оны қайта тотықтырады. Жасушалар оттегіні азайтқаннан кейін жалпы үдерісте тотықсыздану басым болып, түтіктегі ерітінді түссізденеді. Демек, соңғы нүкте тыныс алу, бояғыш концентрациясы және оттегінің қолжетімділігі арасындағы теңгерімді көрсетеді. Оны молекулалық оттегіні тұтынудың тікелей жылдамдығы емес, метилен көгінің тотықсыздану немесе түссіздену уақыты ретінде көрсету керек.

Өлшеу уақыты ыңғайлы аралыққа түсуі үшін тіршілікке қабілеттілікті бағалаудағыдан әлдеқайда сұйылтылған бояғыш қолданыңыз. AQA A level міндетті практикалық жұмыстар анықтамалығы мұны жақсы стандарттайды: шамамен 30 C-ге дейін жылытылған 100 mL суға 1 g глюкоза, қолданар алдында бірден қосылатын 5 g кептірілген ашытқы және 1% бастапқы ерітіндінің 0.1 mL көлемін 100 mL-ге дейін сұйылту арқылы дайындалатын шамамен 0.001% жұмыс бояғышы. Ашытқы-глюкоза суспензиясының 2 mL көлемін 2 mL жұмыс бояғышымен араластырыңыз, сынақ температурасында тепе-теңдікке жеткізіңіз, бір рет 10 секунд шайқаңыз, таймерді іске қосыңыз және қайта шайқамаңыз. Шайқау оттегіні қайта енгізіп, түтіктегі ерітіндіні қайта көгертеді; бұл — рәсімдік артефактілердің ең елеулісі. AQA қоспа әдетте 35 C-де шамамен 5 минут ішінде түссізденуі тиіс екенін атап өтеді; сынақтардағы орташа уақыт 20 C-де 275 s, 35 C-де 128 s және 45 C-де 145 s болған. Бұлар әмбебап эталондар емес, бір тәжірибелік қондырғыдан алынған мысалдар. Бақыланатын жағдайларда тотықсыздану жылдамдығы мен метаболизмдік белсенді ашытқы арасындағы сандық байланыс арнайы тотықсыздану зерттеулерімен, соның ішінде PMID 25773544 ретінде индекстелген жұмыспен және Yeast (2014) журналындағы механизмді зерттеумен расталады.

Уақыт барысының көрсетілімі (арнайы әзірленген материал)

Төмендегі кесте осы мақала үшін жоғарыда сипатталған AQA үлгісіндегі қондырғыға сүйеніп әзірленген көрсетілім болып табылады: 2 mL ашытқы-глюкоза қоспасына шамамен 0.001% жұмыс бояғышының 2 mL көлемі қосылады, бір рет 10 секунд шайқалады, содан кейін қозғамай инкубацияланады. Жазбалар — студенттер тобы тіркеуге тиіс форматтағы мысал мәндер; жылдамдық индексі 1-ді секундпен берілген түссіздену уақытына бөлу арқылы анықталады. Дәл осындай түтіктермен тәжірибе жүргізіп, бұл жазбаларды өлшенген мәндермен ауыстырыңыз.

A, B және C түтіктері үшін жылдамдық индексінің температураға тәуелділік графигін салыңыз. Қисық алдымен көтеріледі, содан кейін жазықталады немесе төмендейді; бұл — түзу сызық емес, ферменттер басқаратын үдеріске тән күтілетін көрініс. D, E және F түтіктері осы қисықтағы дерек нүктелері емес. Олар қисықты түсіндіруге мүмкіндік беретін бақылаулар.

Әр сынаманың нәтижесін мәнді ететін бақылаулар

Әр тыныс алу сынағына үш бақылау қатар жүргізілуі керек. Қайнатылған немесе өлтірілген ашытқы, глюкоза және бояғыш қоспасы көк күйінде қалуы тиіс: бұл жылдам тотықсызданудың тірі жасушалардың метаболизміне тәуелді екенін дәлелдейді. Қосымша глюкозасыз тірі ашытқы мен бояғыш қоспасы — субстраттық бақылау, бірақ ашытқы ішкі қорларын жұмсайтындықтан, мұнда да баяу түссізденуді күтіңіз. Ашытқысыз глюкоза мен бояғыш қоспасы — химиялық бос сынама; ол қажет, өйткені сілтілі ортадағы глюкоза жасушаларсыз-ақ метилен көгін тотықсыздандыра алады.

Тіршілікке қабілеттілікті санауға басқа бақылау қажет: рәсімнің тұрақтылығы. Бояғыштың бастапқы ерітіндісі, араластыру қатынасы, бояу аралығы, камера аумағы, бүршік пен шекара ережелері бірдей болуы тиіс; мүмкін болса, үлгі туралы ақпаратты білмей санау керек. Екі оператордың нәтижелері он тармаққа алшақтаса, санау парағы әдетте себебін көрсетеді: уақыттың, көк түсті ажырату шегінің немесе бүршік ережелерінің әртүрлі болуы. Боялған жасушаларды дайындау және қарау тәсілдері бактерияларды қарапайым бояу әдістерімен байланысты, ал бояғыштың әртүрлі үлгілерде нені белгілейтіні туралы кеңірек шолу микроскопиялық бояу атласында берілген. Көк түс қарқындылығын сандық бағалаудың физикалық негізін түсіну үшін жағдайлары көрсетілген жұтылу анықтамалығын қараңыз: ол әр коэффициентпен бірге еріткіш, pH және концентрация жағдайлары неліктен көрсетілуі тиіс екенін түсіндіреді.

Сынаманы сұраққа қарай таңдаңыз. Дәл қазір қанша жасуша тірі деген сұраққа микроскоп пен санау парағы арқылы жауап беріледі. Бұл дақыл қаншалықты белсенді тыныс алып жатыр деген сұрақ — кинетикалық сұрақ; оған секундомер және бақыланатын түтіктер арқылы жауап беріледі. Метилен көгі екеуіне де жарайды, бірақ бір түтікте бір мезгілде екеуіне бірдей қолданылмайды.