Метилен көгі және ALS: құрт, балық және тышқан нәтижелерін салыстыру

Метилен көгі мен ALS туралы іздесеңіз, бір-біріне қайшы көрінетін екі тұжырымды кездестіресіз. Бірінде көк бояғыш ALS модельдерінде нейрондарды қорғағаны айтылады. Екіншісінде оның ALS тышқан моделінде еш әсер етпегені жазылған. Екі тұжырым да нақты ғылыми мақалаларға сүйенеді, әрі екі мақала да байыппен қарауға тұрарлық. Әр эксперименттің негізіндегі ұстанымды айқын айтқанда, қайшылық жойылады: модель тұжырымның ауқымын анықтайды.

Құрттағы нәтиже — құрт туралы тұжырым. Балық дернәсіліндегі нәтиже — балық дернәсілі туралы тұжырым. Сүтқоректілердегі ауру ағымын зерттеу мұны растамайынша, екеуі де пациентке қатысты тұжырым емес. Бұл мақалада ең жиі сілтеме жасалатын екі зерттеу қатар салыстырылады, сондықтан олардың жауаптары неге әртүрлі екенін көре аласыз.

Екі эксперимент бір кестеде

Оқу барысында осы кестені ашық ұстаңыз. Зерттеулер арасындағы барлық маңызды айырмашылық осында қамтылған.

	Құрт пен балықтағы TDP-43 және FUS	Тышқандағы SOD1
Мақала	Vaccaro және әріптестері, 2012, PLoS ONE журналында	Lougheed және Turnbull, 2011, PLoS ONE журналында
Ағза	C. elegans жұмыр құрты және зебрабалық дернәсілдері	Адамның SOD1 G93A генінің көшірме саны жоғары конгенді тышқан
Модельденген ALS генетикасы	Адамның мутантты TDP-43 ақуызы (құрттарда A315T, балықтарда G348C) және мутантты FUS ақуызы (құрттарда S57Δ, балықтарда R521H)	Адамның мутантты SOD1 G93A ақуызы — отбасылық ALS себептерінің бірі
Әсер ету жағдайлары	Зат қосылған ортада ұстау: жұмыртқадан шыққаннан бастап табақшаларда 6 немесе 60 μM, қысқа мерзімді сұйық орта скринингінде 600 μM, балық эмбриондары үшін түні бойы 30–60 μM	Дәм берілген желатинмен ауыз арқылы тәулігіне шамамен 25 mg/kg, 45 күндік жастан соңғы сатыға дейін күн сайын
Соңғы көрсеткіштер	Салдану, қозғалтқыш нейрон өсінділерінің дегенерациясы, синапстық сынақ, балықтың жүзуі мен аксон пішіні, тотығу стрессінің көрсеткіштері	Неврологиялық белгілердің басталуына дейінгі уақыт, реттік шкала бойынша ауру сатыларының ұзақтығы, белгіленген соңғы сатыға дейін тірі қалу, дене салмағы
Негізгі нәтиже	Қозғалыс пен нейрон құрылымының айқын қалпына келуі	Жалпы басталу уақытының статистикалық мәнді кешігуі де, тірі қалу ұзақтығының статистикалық мәнді артуы да болмады

Генетикасы, түрлері, енгізу жолы, уақыты және соңғы көрсеткіштері әртүрлі. Генотип — бес айырмашылықтың біреуі ғана, сондықтан бұл екі зерттеу метилен көгінің ALS-тің бір жолына таңдамалы әсер ететінін дәлелдей алмайды. Олар ауқымы тарлау, бірақ бәрібір пайдалы бір жайтты көрсетеді: қарапайым модельдерде ерте әрі тікелей әсер ету кезіндегі айқын қалпына келу сүтқоректідегі ауру ағымын ұзақ мерзімді ауыз арқылы енгізумен зерттегенде қайталанбаған.

Оң нәтиже: құрт пен балық зерттеуі нені көрсетті

2012 жылғы құрт пен балық зерттеуінде құрттардың қозғалтқыш нейрондарында адамның мутантты TDP-43 немесе FUS ақуызы экспрессияланды, ал балық эмбриондарына адамның мутантты мРНҚ-сы енгізілді. Бұлар — протеоуыттылық модельдері. Олар ересек адамдағы ALS-тің жылдарға созылатын толық ағымын емес, мутантты ақуыздың қозғалыс пен нейрон пішініне бірнеше күн ішінде тигізетін уытты әсерлерін жаңғыртады.

Ем өте ерте басталды. Құрттар жұмыртқадан шыққаннан бастап метилен көгі бар агарда өсті. Балық эмбриондары ұрықтанудан кейінгі 24 сағаттан бастап түні бойы препарат ерітіндісінде ұсталды, ал мінез-құлқы шамамен екі күннен кейін тексерілді. Препарат пен нейрон арасында сүтқоректілердегідей гематоэнцефалдық тосқауыл болмады, әрі плазмадағы немесе мидағы препарат деңгейі өлшенбеді.

Осындай жағдайларда әсерлер айқын әрі бірізді болды. 6 және 60 μM концентрацияларының екеуі де TDP-43 және FUS құрттарында жасқа байланысты салдануды азайтты. Ересек кезеңнің 12-күнінде ем алмаған TDP-43 құрттарының шамамен 80 пайызы салданған, ал жұмыртқадан шыққаннан бастап ем алған құрттарда бұл көрсеткіш шамамен 10 пайыз болды. Синапстық сынақ та осы бағытты көрсетті: TDP-43 құрттары жүйке-бұлшықет сигналдарының берілуін зерттеуге арналған альдикарб препаратына аса сезімтал болды, ал метилен көгі олардың жауабын қалыпты деңгейге қарай ығыстырды. Дегенерацияға ұшыраған қозғалтқыш нейрон өсінділерінің саны азайды, ең айқын әсер 60 μM концентрациясында байқалды. Балықтарда жанасуға жауап ретінде жүзу едәуір жақсарды, ал қысқарған қозғалтқыш аксондар 30 немесе 60 μM концентрациясында қалыпты ұзындыққа қарай қайта өсті, бірақ қалпына келу толық емес, ішінара болды.

Тотығу стрессі жөніндегі деректер антиоксиданттық әсер түсіндірмесіне сәйкес келді. Мутантты құрттар мен балықтарда реактивті оттегі көрсеткіштері жоғары болды және емнен кейін төмендеді; ал метилен көгі берілген қалыпты құрттар прооксиданттық әсер кезінде ем алмаған құрттарға қарағанда әлдеқайда ұзақ тірі қалды. Бірақ екі шектеу маңызды. Мутантты TDP-43 және FUS ақуыздарының жалпы деңгейі төмендеген жоқ, әрі зерттеуде ақуыз агрегаттарының мөлшері тікелей өлшенбеді. Сондықтан ол функцияның қалпына келгенін көрсетеді, бірақ агрегаттардың жойылғанын дәлелдемейді. Тотығу-тотықсыздану және митохондриялық гипотезалардың әдетте қалай тұжырымдалатынын қадағалайтындар бұл механизмді деректермен қолдау тапқан, бірақ түпкілікті анықталмаған деп қарастыруы керек.

Ең көп ой салатын жайт — емнің басталу уақыты. Авторлар емді ересек кезеңнің 5-күніне дейін кейінге қалдырғанда, 12-күнгі салдану үлесі шамамен 55 пайыз болды; ал жұмыртқадан шыққаннан бастап емдегенде ол шамамен 10 пайыз еді. Препарат та, құрт та, мутация да бірдей, бірақ әсер әлдеқайда аз. Байқалған пайданың едәуір бөлігі ерте профилактикалық әсер етуге байланысты болды.

Әсер анықталмаған нәтиже: SOD1 тышқан зерттеуі нені көрсетті

2011 жылғы тышқан зерттеуі күрделірек сұрақты неғұрлым қатаң жүйеде қарастырды. Конгенді SOD1 G93A тышқандарында ауру артқы аяқтардың дірілінен жүрістің бұзылуына, денесін қалыпты күйге келтіру рефлексінің жоғалуына, содан кейін алдын ала белгіленген соңғы көрсеткішке дейін өршиді. Ем белгілер пайда болмай тұрып, 45-күні басталып, күн сайын жалғасты; бақылаушылар неврологиялық жағдайды 0-ден 6-ға дейінгі шкаламен бағалады. Бұл — аурудың толық ағымын қамтитын эксперимент, сондықтан ол құрттағы кез келген салдану қисығына қарағанда пациент үшін маңызды мәселелерге жақынырақ.

Негізгі көрсеткіштер бойынша әсер анықталмады. Ауру белгілерінің жалпы басталу уақыты бақылау тобында 121 күн, ал метилен көгі тобында 124 күн болды; айырмашылық статистикалық мәнді емес еді. Соңғы сатыға дейінгі тірі қалу ұзақтығы 167 күнге қарсы 170 күн болды, бұл да статистикалық мәнді емес. Бірнеше қосалқы талдау емнің пайдасына нәтиже берді: ұрғашыларда белгілердің басталуы шамамен 7 күнге кешікті, ал ем алған жануарлар жеңілірек сатыларда сәл көбірек, ауыр сатыларда азырақ уақыт өткізді. Жыныс бойынша шағын топтар мен сатылар арасындағы көптеген салыстыруды ескерсек, бұл нәтижелер дәлелден гөрі гипотеза ұсынуға негіз болады. Нейрондар саны, SOD1 агрегаттануы, тотығу немесе қабыну маркерлері өлшенбеді. Сондықтан зерттеу препарат өз нысаналарына жетіп, әсер ете алмады ма, әлде осы дозада олармен мүлде әрекеттеспеді ме деген сұраққа да жауап бере алмайды. Тек бір доза тексерілді.

Авторлардың өздері екі бағытқа да қатысты ең маңызды шектеуді атап өтті. Көшірме саны жоғары SOD1 G93A моделі SOD1-дің уытты әсеріне байланысты ауруды жақсы модельдейді, бірақ SOD1-мен байланысты ауру отбасылық ALS-тің шағын бөлігін ғана құрайды және оның биологиясы спорадиялық ауру жағдайларының көпшілігінен өзгеше. Олар ықтимал препараттарды TDP-43 негізіндегі сүтқоректі модельдерінде қайта тексеруді ұсынды. Содан бері бұл ұсыныс күрделене түсті, өйткені құрт пен балық зерттеуінің авторлары метилен көгін TDP-43 тышқан моделінде зерттеген басқа жұмыста да қозғалыс көрсеткіштері жақсармағанын атап өтеді. Демек, бір қосылыс бір TDP-43 жүйесінде айқын әсер көрсетіп, басқа TDP-43 жүйесінде әсерсіз болуы мүмкін. Жүйе ген сияқты маңызды.

Құрттағы немесе балықтағы жақсару неге пациенттерге пайдасын дәлелдей алмайды

Әр модельді әртүрлі сұраққа жауап беретін жүйе ретінде қарастырыңыз.

Біріншіден, биологиясы өзгеше. TDP-43 және FUS — нуклеин қышқылдарымен байланысатын ақуыздар; осы қарапайым жүйелерде олардың ортақ генетикалық өзара әрекеттесулері бар. Ал SOD1 уыттылығы ішінара бөлек бастапқы механизмдер арқылы жүреді. Протеоуытты стресстің бір түрін жеңілдететін препарат екіншісін міндетті түрде жеңілдетпейді. Эмбриондағы шамадан тыс экспрессияға қарсы табыс қабыну, глияның қатысуы және бүкіл ағзаның әлсіреуімен қатар жүретін ересек кезеңдегі баяу нейродегенерацияға қарсы табысты міндетті түрде болжамайды.

Екіншіден, әсер ету жағдайлары өзгеше. Микромолярлық концентрациядағы ерітіндіде үздіксіз ұстау ауыз арқылы енгізумен бірдей емес. Жұтылған доза мен жұлындағы қозғалтқыш нейронның арасында ішекте сіңу, алғашқы өту метаболизмі, плазма ақуыздарымен байланысу, миға өту және ағзадан шығарылу үдерістері бар. Екі зерттеуде де жүйке жүйесіндегі препарат деңгейі өлшенбеген, сондықтан олардың ешқайсысы өз концентрациясын екіншісінікімен байланыстыра алмайды.

Үшіншіден, басталу уақыты өзгеше. Құрт пен балықтағы пайда патологиялық өзгерістер жиналмай тұрып басталған емге қатты тәуелді болды. Тышқандардағы ем де белгілерге дейін басталды, бұл — зерттеудің артықшылығы. Дегенмен адамдарда ем әрдайым дерлік белгілер басталғаннан кейін, яғни одан да кеш басталады. Екі күндік эмбрион сынағындағы профилактикалық әсер белгісі — клиникалық қолданудың моделі емес, зерттеуге арналған бастапқы нүкте.

Төртіншіден, соңғы көрсеткіштер өзгеше. 12 күндегі салдану, альдикарбқа сезімталдық, микрометрмен өлшенген аксон ұзындығы және жүзу қашықтығы — механизмге жақын фенотиптер. Сүтқоректідегі аурудың басталуы мен тірі қалу ағзадағы барлық өтемдік және жағдайды күрделендіретін үдерістерді біріктіріп көрсетеді. Препараттар мұндай тікелей көрсеткіштерді жиі өзгертеді, бірақ тірі қалуды өзгертпейді. Сондықтан сүтқоректілерде оқиғаға дейінгі уақытты бағалайтын соңғы көрсеткіштер қолданылады.

Келесі жаңалық тақырыбын бағалауға арналған тексеру тізімін іздеген оқырмандар оны клиникаға дейінгі зерттеулерді қалай оқу керек мақаласынан ала алады: ағзаның түрін, трансгенді, дозаны және енгізу жолын; препарат деңгейі өлшенді ме; ем патологияға қатысты қай кезде басталды; соңғы көрсеткіш қысқа мерзімді фенотип пе, әлде ауру ағымы ма; әсер екінші зертханада қайталанды ма — осыны сұраңыз. Осы ерте белгілердің клиникалық деректерге айналған-айналмағанын тексеру үшін метилен көгіне қатысты адамдардағы кеңірек дәлелдер базасына жүгіну қажет.

Бұл пациенттер мен отбасылар үшін нені білдіреді

Бұл мақалалардан ALS үшін метилен көгін қолданудың орныққан хаттамасы туындамайды. Оң нәтиже берген зерттеу TDP-43 және FUS биологиясындағы тотығу және синапстық механизмдерді әрі қарай зерттеуге негіз болады. Әсер анықталмаған зерттеу SOD1 типті ауруда осы әсер ету деңгейіндегі ұзақ мерзімді ауыз арқылы енгізуден ауру ағымын өзгертуді күтуге қарсы дерек береді. Екеуі бірге ем жөніндегі ұсынысты емес, модельдер арасындағы сәйкессіздікті сипаттайды.

Қауіпсіздікке де тиімділік сияқты байыппен қарау керек. Тышқандардағы ALS зерттеулері адамдарға қауіпсіз доза туралы ештеңе айтпайды. Метилен көгі G6PD тапшылығында гемолиз арқылы және серотонинергиялық препараттармен бірге қолданылғанда серотониндік уыттылық арқылы нақты қауіп төндіреді. G6PD тапшылығына күдік, қазір антидепрессант қабылдау және дәрі-дәрмекке жоспарланған кез келген өзгеріс дәрігермен талқылануы керек. Зертханалық жаңалықтарға сүйеніп әрекет етпес бұрын метилен көгінің қауіпсіздігі туралы жалпы деректерді қарастыру да осы талқылауға жатады.

Негізгі қорытындыны бір сөйлеммен айтуға болады. Метилен көгі ерте әсер ету жағдайында TDP-43 және FUS құрттары мен балық дернәсілдерінің фенотиптерін айқын қалпына келтірді, ал ұзақ мерзімді ауыз арқылы енгізілген SOD1 тышқан зерттеуінде аурудың басталуына немесе тірі қалуға іс жүзінде пайда бермеді; сондықтан адал түсіндірме — бұл модельге тәуелді деректер және олар пациенттерде қолдануды негіздемейді.