Мақала
EMB агарындағы E. coli және басқа колониялардың сыртқы көрінісін бағалау
Студент белгісіз микроорганизмді эозин-метилен көгі агарына штрихтап егіп, түні бойы инкубациялайды. Келесі күні табақшада жасыл жылтыры бар күңгірт колонияларды көреді. Дәптеріне «E. coli, расталды» деп жазады. Бұл жазба табақша нәтижесі негіздей алатыннан артық тұжырым жасайды. Табақша белгілі бір жағдайларда өсу мен ферментация фенотипін көрсетеді. Микроорганизмнің түрін анықтау — бөлек дәлелдерді қажет ететін бөлек тұжырым.
Бұл нұсқаулық EMB агарының нәтижелерін түсіндіру міндеті ретінде қарастырады. Ол әдістің негізгі қағидасын түсіндіреді, бақылау үлгілері бар иллюстрациялық табақшалар атласын ұсынады және оқулықтағы көрініс жаңылыстыратын жағдайларды көрсетеді.
Табақшаның негізіндегі қағида
EMB агары әрі селективті, әрі дифференциалды орта болып табылады. Эозин Y мен метилен көгі бояғыштары көптеген Грам-оң микроорганизмдердің өсуін тежейді, сондықтан орта Грам-теріс микроорганизмдердің өсуіне қолайлырақ. Сол бояғыштар индикатор қызметін де атқарады: микроорганизм ортадағы қантты ферменттеп, жергілікті жерде жеткілікті қышқыл түзгенде, колония бояғышты көп сіңіріп, қою күлгіннен көк-қараға дейінгі түске енеді. Қышқыл қарқынды түзілгенде, колония бетінде құбылмалы металдық жасыл жылтыр пайда болуы мүмкін. Эозин-метилен көгі агары бар табақшаларға арналған ASM хаттамасы селективтілік пен дифференциацияның осы үйлесімін сипаттап, оқытуға арналған эталондық фотосуреттерді ұсынады.
Кез келген нәтижені бағаламас бұрын бір маңызды жайтты тексеру керек: ортаның қай құрамы қолданылғанын анықтаңыз. Ескі Holt Harris Teague құрамында лактоза мен сахароза бар, ал Levine EMB құрамында тек лактоза болады. Лактозаны емес, сахарозаны ферменттейтін микроорганизмдер, мысалы Serratia marcescens изоляттарының көбі, осы екі нұсқада әртүрлі көрінуі мүмкін. EMB орталарына арналған өндіруші құжаттамасында құрамдардың бұл айырмашылығы нақты көрсетілген. Дәптерге нәтижемен бірге өндірушіні және ортаның құрамын жазыңыз.
Дайын, әлі егілмеген EMB агарының түсі әдетте қызыл-қоңырдан қызғылт күлгінге дейін болады, кейде жасылдау реңкі немесе ұсақ тұнбасы байқалады. Бұл фондық түс өсу белгісі емес. Әр нәтижені егілмеген табақшамен немесе құжатталған бастапқы көрініспен салыстырыңыз. Оқу хаттамасында басқаша көрсетілмесе, бастапқы табақшаны 35 to 37 C температурада шамамен 18 to 24 сағат аэробты инкубациядан кейін бағалаңыз. Ұзақ инкубация ферментацияның сыртқы көрінісін өзгертуі мүмкін.
Табақшаны қалай қарау керек
Жарықтандырудың екі түрін қолданыңыз. Алдымен табақшаны шағылған немесе қиғаш түскен жарықта қарап, еңкейтіңіз: металдық жылтыр құбылмалы болады және қарау бұрышына қарай пайда болуы немесе жоғалуы мүмкін. Содан кейін колонияның түсі мен күңгірт ортасын бағалау үшін табақшаны өтпелі жарықта қараңыз. Бір-бірінен жақсы оқшауланған колонияларды бағалаңыз, өйткені тығыз орналасу мен көрші колониялар жергілікті қышқыл жиналуын өзгертіп, түсті әлсіретуі немесе күшейтуі мүмкін. ASM суреттер жинағы мұны тікелей көрсетеді: аралас дақылдағы E. coli күтілетін жылтырын жоғалтуы мүмкін, себебі айналасындағы микроорганизмдер ортаның қышқылдығын өзгертеді.
Оқу тапсырмасы мүмкіндік бергенде бақылау үлгілерін қосыңыз. Жиі қолданылатын оқу жиынтығына көк-қара түс пен металдық жылтыр фенотипі үшін E. coli ATCC 25922, түссіз фенотип үшін Salmonella Typhimurium ATCC 14028 немесе Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853 сияқты ферменттемейтін микроорганизм, ал тежелуді бақылау үшін Enterococcus faecalis немесе Staphylococcus aureus сияқты Грам-оң микроорганизм кіреді. Бұлар EMB орталарына арналған стандартты сапаны бақылау кестелерінде берілген. Оң бақылау үлгісінде жылтыр болмаса, белгісіз микроорганизмге күмән келтірмес бұрын инкубацияны, колониялардың тығыздығын немесе орта құрамын тексеріңіз.
Иллюстрациялық табақшалар атласы
Төмендегі табақшалар — нақты дақылдардың фотосуреттері емес, жасалған иллюстрациялар. Олар белгілі бір штамның дәл реңкін емес, назар аудару қажет көріністі көрсетеді. Оларды ASM эталондық фотосуреттерімен және оқу зертханасындағы нақты табақшалармен салыстырыңыз.
Табақша 1: EMB агарындағы Escherichia coli, лактозаны қарқынды ферменттейтін микроорганизм
EMB агарындағы E. coli әдетте қою күлгіннен көк-қараға дейінгі түсте болады; көбіне ортасы күңгірт және қышқылдың қарқынды түзілуінен металдық жасыл жылтыры байқалады. Бұл жылтыр — студенттер іздейтін әйгілі белгі, бірақ оны анықтаушы белгі емес, қосымша дәлел ретінде қарастырыңыз. Жылтырдың қарқындылығы штамға, инкубация уақытына, колониялардың тығыздығына және қарау бұрышына байланысты өзгереді. Жылтырдың болмауы E. coli бар екенін жоққа шығармайды, ал жылтырсыз күңгірт колония бірнеше басқа ферменттеуші микроорганизмге тән болуы мүмкін. Кейінгі жұмыстар үшін тығыз өскен секторды бағалаудың орнына, жақсы оқшауланған колонияны таңдаңыз.
Табақша 2: EMB агарындағы Klebsiella pneumoniae, шырышты колония түзетін ферменттеуші микроорганизм
EMB агарындағы Klebsiella pneumoniae әдетте қызғылт-күлгіннен қоңыр-күлгінге дейінгі реңктері бар, ірі, жылтыраған, шырышты колониялар түзеді. Олардың ортасы жиі күңгірт болады, бірақ айқын металдық жылтыры әдетте болмайды. Ұқсас морфология Enterobacter сияқты туыстас ферменттеуші микроорганизмдерде де кездеседі. Шырышты консистенция мен колония өлшемі де бағалаудың бір бөлігі: ұсақ әрі жалпақ қызғылт колонияның диагностикалық мәні ірі, күмбез тәрізді шырышты колониядан өзгеше. E. coli жағдайындағыдай, табақша ферментация фенотипін ғана меңзейді, ал түр деңгейінде атау үшін төменде сипатталған биохимиялық растау қажет.
Табақша 3: EMB агарындағы Salmonella және басқа ферменттемейтін микроорганизмдер, түссіз колониялар
EMB агарындағы Salmonella және лактозаны ферменттемейтін басқа микроорганизмдер, соның ішінде Shigella мен Pseudomonas изоляттарының көбі, әдетте түссіз, жартылай мөлдір немесе бозғылт кәріптас түсті колониялар түрінде өседі. Кейбір құрамдар мен жағдайларда әлсіз қызғылт реңк пайда болады, сондықтан бозғылт қызғылт колонияны бірден ферменттеуші деп санауға болмайды. EMB Salmonella-ны Shigella-дан немесе басқа ферменттемейтін микроорганизмдерден ажыратпайды; бұл айырмашылық кейінгі сынақтарда анықталады. Сондай-ақ лактозаны ферменттейтін, E. coli-ге ұқсас металдық жылтыры бар колониялар түзетін Salmonella штамдары тіркелгенін ескеріңіз. Бұл — бір ғана табақша түпкілікті қорытынды жасауға жеткіліксіз екенінің тағы бір себебі.
Табақша 4: Serratia marcescens және орта құрамының жаңылыстыруы
Serratia marcescens үшін жеке бөлім қажет, себебі студенттер жиі қызыл колонияларды күтіп, табақшаны қате бағалайды. Клиникалық изоляттардың көбі лактозаны ферменттемейді, сондықтан Levine EMB-де олар әдетте бозғылт немесе әлсіз боялған болып көрінеді. Көптеген изоляттар сахарозаны ферменттейтіндіктен, сахарозасы бар құрам күңгірттеу немесе қышқыл түзілуіне көбірек байланысты реакция беруі мүмкін. 35 to 37 C температурада классикалық қызыл продигиозин пигментін де күтпеңіз; инкубатор температурасында пигменттің түзілуі тұрақсыз. Хаттамада EMB агарындағы Serratia marcescens туралы айтылса, тұжырымның қай құрамға қатысты екенін тексеріңіз. Serratia метаболизміне шолу бұл жаңылыстырудың негізінде жатқан лактозаны ферменттемеу және сахарозаны ферменттеу қабілетінің өзгермелілігін қорытындылайды.
Табақша 5: бақылау үлгілері және өсуі тежелген микроорганизмдер
Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus және Bacillus сияқты Грам-оң микроорганизмдердің өсуі EMB агарында әдетте тежеледі немесе айтарлықтай бәсеңдейді, бірақ тежелу барлық штам үшін толық бола бермейді. Бақылау үлгілерінің жиынтығы нәтижені негізді бағалауға мүмкіндік береді: E. coli бақылау үлгісі көк-қара түсі мен жылтыры бар жақсы өсу көрсетуі керек, ферменттемейтін микроорганизмнің бақылау үлгісі түссіз өсу көрсетуі керек, ал тежелуді бақылау үлгісінде өсу аз немесе мүлде болмауы керек. Егер тежелуді бақылау үлгісі жақсы өссе, селективтілік шарты орындалмаған, сондықтан сол партиядағы барлық басқа нәтижелер күмәнді. Бояу әдістері қоректік орталардан басқа сұраққа жауап береді; зертханада заттық әйнектегі препараттарды бояу туралы метилен көгімен бояу атласын қараңыз.
Шектеулері ескерілген салыстыру
| EMB агарындағы бақылау | Ықтимал мағынасы | Нені дәлелдемейді |
|---|---|---|
| Қиғаш жарықта жасыл жылтыры бар қою көк-қара колония | Қарқынды ферментация, негізгі ықтимал нұсқа — E. coli | Түрлік сәйкестік; басқа қарқынды ферменттеушілерде де жылтыр болуы мүмкін |
| Ірі шырышты қызғылт-күлгін колония, жылтыры жоқ | Капсулалық сипаты бар ферменттеуші микроорганизм, ықтимал нұсқа — Klebsiella | Нақты Klebsiella pneumoniae екенін; Enterobacter ұқсас көрінеді |
| Түссіз немесе жартылай мөлдір колония | Лактозаны ферменттемейтін микроорганизм, мысалы Salmonella, Shigella, Pseudomonas | Қай ферменттемейтін микроорганизм екенін; Salmonella мен Shigella-ны ажырату үшін басқа сынақтар қажет |
| Қызыл түс күтілген жерде бозғылт колония | 37 C температурада тек лактозасы бар EMB-де өскен Serratia болуы мүмкін | Serratia жоқ екенін; құрам мен температураны тексеріңіз |
| Өсу жоқ немесе өсуі тежелген өте ұсақ колониялар | Грам-оң микроорганизмдердің өсуі тежелген болуы мүмкін | Стерильділікті немесе түрлік сәйкестікті; кейбір штамдар тежелуге қарамастан өседі |
Жаңылыстыратын көріністерді үш сөйлеммен қорытындылауға болады. Күңгірт түс E. coli деген сөз емес, өйткені Klebsiella, Enterobacter және басқа ферменттеуші микроорганизмдер жылтырсыз күңгірт ортасы бар колониялар түзеді. Қызғылт түс Klebsiella деген сөз емес, өйткені орташа немесе баяу ферменттеушілер және ферменттемейді деп саналатын кейбір микроорганизмдер қызғылт не ашық күлгін болып көрінеді. Жылтыр E. coli-дің түпкілікті дәлелі емес, өйткені оны басқа қарқынды ферменттеушілер де түзе алады. Оқу хаттамасы мен ондағы аралас дақыл суреттері осы жаңсақтықтардың әрқайсысын көрсетеді.
Растаудың шектеулері
EMB агары түрді емес, фенотипті көрсетеді. Әртүрлі микроорганизмдердің колониялары бірдей көрінуі мүмкін, ал бір микроорганизмнің өзі штамға, жасына, колониялардың тығыздығына, орта құрамына және инкубацияға байланысты оқулықтағы көріністен ауытқуы мүмкін. Сондықтан оқу және клиникалық жұмыс үдерістерінде EMB морфологиясы алдын ала болжам жасауға арналған белгі ретінде қарастырылады.
Студент үшін негізді жұмыс реті мынадай: оқшауланған колонияны сипаттау (өлшемі, түсі, ортасы, қиғаш жарықтағы жылтыры, шырышты сипаты), орта құрамын, инкубация уақыты мен температурасын және бақылау үлгілерін тіркеу; содан кейін кез келген растаушы сынаққа дейін жақсы оқшауланған колонияны қайта егіп, таза дақыл алу. Әдеттегі кейінгі зерттеулерге E. coli мен колиформдарды алдын ала анықтау үшін Грам бойынша бояу және IMViC реакциялары, ішек микроорганизмдері үшін TSI немесе KIA және микроорганизмге тән биохимиялық сынақтар жиынтығы кіреді. Міндет талап етсе, серологиялық, MALDI TOF немесе басқа валидацияланған сәйкестендіру әдістері қолданылады. EMB-нің селективті және дифференциалды ішек орталары арасындағы орны туралы жалпы мәлімет үшін ішек микроорганизмдерін өсіруге арналған қоректік орталарға кіріспелерді және кейінгі Грам бойынша бояуды қараңыз. Заттық әйнектегі препаратты көк бояғышпен бояу нені дәлелдей алатыны және нені дәлелдей алмайтыны туралы байланысты сұрақта метилен көгімен бояу атласы дәл осы қағидамен бақылау мен қорытындыны бөлек қарастырады.
Қорытындыдан бұрын бақылау нәтижесін жазыңыз. «Levine EMB-де 24 сағаттан кейін қарау бұрышына тәуелді жасыл жылтыры бар қою көк-қара колониялар байқалды, бұл лактозаның қарқынды ферментациясына сәйкес келеді» — негізді тұжырым. «E. coli, расталды» деу үшін табақша нәтижесінің өзі қамтамасыз ете алмайтын растау кезеңі қажет.