მეთილენის ლურჯის საკალიბრაციო მრუდის აგება: ბლანკები, დიაპაზონი და წრფივობა

ორი ანალიტიკოსი მეთილენის ლურჯის ერთი და იმავე საწყისი ხსნარის ბოთლს იყენებს და თითოეული საკალიბრაციო მრუდს აგებს. პირველი იღებს კოორდინატთა სათავეზე გამავალ სწორ ხაზს და უცნობი ნიმუშების გაზომვის შედეგებს ენდობა. მეორე იღებს ხაზს, რომელიც ზედა ნაწილში იხრება, თავისუფალ წევრს, რომელიც ნულს არ უახლოვდება, და ნიმუშების შედეგებს, რომლებიც განზავებასთან ერთად იცვლება. იგივე საღებავი, იგივე ხელსაწყო, იგივე ტალღის სიგრძე. განსხვავება უნარებში არ არის. ის ექსპერიმენტის დაგეგმვაშია: რა შედიოდა ბლანკში, რომელი კონცენტრაციები შეირჩა და დარჩა თუ არა შემოწმებული დიაპაზონი იმ არეში, სადაც ერთი მარტივი მოდელი ჯერ კიდევ მოქმედებს.

საკალიბრაციო მრუდი ხელსაწყოს სიგნალსა და კონცენტრაციას შორის შეთანხმებაა, რომელიც მხოლოდ იმ პირობებშია ძალაში, რომლებშიც ის აიგო. მეთილენის ლურჯის შემთხვევაში ამ შეთანხმებას ცნობილი სუსტი წერტილი აქვს. საღებავი წყალში თვითასოცირდება, ამიტომ სინათლის მშთანთქმელი ფორმა კონცენტრაციასთან ერთად იცვლება. ამ ცვლილების მომცველ დიაპაზონზე აგებული მრუდი სწორი არ იქნება და ამას ვერანაირი სტატისტიკა ვერ გამოასწორებს. ეს სტატია გვიჩვენებს, როგორ დავგეგმოთ მრუდი ისე, რომ ხაზს რეალური მნიშვნელობა ჰქონდეს: შევარჩიოთ სწორი ბლანკი, დიაპაზონი მონომერულ რეჟიმში შევინარჩუნოთ, განმეორებითი გაზომვები კეთილსინდისიერად ჩავატაროთ და მრუდის გამრუდება ინფორმაციად აღვიქვათ და არა ხმაურად.

დაიწყეთ ბლანკით და არა სტანდარტებით

ბლანკი განსაზღვრავს ნულს და მეთილენის ლურჯის შემთხვევაში ის საღებავის გარდა ყველაფერს უნდა შეიცავდეს. წყლის იგივე ხარისხი, იგივე ბუფერი და pH, იგივე მარილები, თანამხსნელის იგივე წილი, იგივე ტემპერატურა. საკალიბრაციო ხსნარები სწორედ ამ იდენტურ მატრიცაში მოამზადეთ. მიზეზი ქიმიურია და არა ბიუროკრატიული. მარილი და გამხსნელი მონომერს, დიმერსა და უფრო მაღალი რიგის აგრეგატებს შორის წონასწორობას ცვლის, რაც გაზომვის ტალღის სიგრძეზე სპექტრს ცვლის. მხოლოდ წყლისგან შემდგარი ბლანკი ვერ შეასწორებს მატრიცით გამოწვეულ ცვლილებას ქიმიური ფორმების განაწილებაში. წყალში მეთილენის ლურჯის სპექტრების გლობალურ ანალიზში, რომელიც ხელმისაწვდომია ღია წვდომის ჩანაწერის მეშვეობით, ნატრიუმის ქლორიდის კონცენტრაციას 0-დან 0.15 M-მდე ცვლიდნენ სწორედ იმიტომ, რომ იონური ძალა წონასწორობას გადაანაცვლებს; მარილის მატებასთან ერთად აგრეგაციაც იზრდებოდა.

ერთი პრაქტიკული შედეგი: არასოდეს ჩაატაროთ კალიბრაცია დეიონიზებულ წყალში და შემდეგ ნიმუშები ფოსფატურ ბუფერში ან ჩამდინარე წყლის ფილტრატში არ გაზომოთ. როდესაც საანალიზო ნივთიერებისგან თავისუფალი მატრიცა არ არსებობს, უშუალოდ ნიმუშში სტანდარტული დამატების მეთოდი შეუსაბამო მატრიცაში აგებულ გარე საკალიბრაციო მრუდზე უკეთესია. წყალხსნარებში ანალიზის სანდოობის შენარჩუნების შესახებ შესაბამისი მითითებები მოცემულია მატრიცისა და ხელშემშლელი ფაქტორების განხილვაში, ხოლო საღებავების რაოდენობრივი ანალიზის ზოგადი პრინციპები — ანალიზის დაგეგმვის მიმოხილვაში.

შეარჩიეთ დიაპაზონი, სადაც ერთი ფორმა დომინირებს

გრძელტალღოვან ზოლში, დაახლოებით 664 nm-ზე, რაოდენობრივი განსაზღვრა ეფუძნება დაშვებას, რომ საღებავის უმეტესი ნაწილი მონომერულია. ჩვეულებრივ წყალში ეს დაშვება მხოლოდ განზავებულ ხსნარებში მოქმედებს, დაახლოებით დაბალ მიკრომოლარულ არეში. გამოქვეყნებული ემპირიული დახრილობები ამ ზღვარს აჩვენებს: 1 cm კიუვეტებში დაახლოებით 7 მიკრომოლარზე დაბალ კონცენტრაციებზე ჩატარებული კალიბრაციები იძლევა დაახლოებით 82,000 M-1 cm-1 დახრილობას, ხოლო დაახლოებით 37 მიკრომოლარამდე გაფართოებული კალიბრაციისას ის დაახლოებით 67,100-მდე მცირდება, რადგან ზედა კონცენტრაციის სტანდარტები უკვე დიმერის მნიშვნელოვან რაოდენობას შეიცავს. აქ მოყვანილი ყველა კოეფიციენტი შესაბამისი პირობების მითითებით მოცემულია მეთილენის ლურჯის სპექტრულ ცნობარში, რომელიც რიცხვების შესადარებლად სათანადო წყაროა; ამ სტატიაში ისინი მხოლოდ დიაპაზონის დასადგენად გამოიყენება.

აქედან უშუალოდ გამომდინარეობს დაგეგმვის წესები:

1. ყველაზე მაღალი კონცენტრაციის სტანდარტი საკმარისად განზავებული უნდა იყოს, რომ სპექტრის ფორმა სტაბილური დარჩეს. მეთოდის შემუშავებისას თითოეული დონისთვის დაასკანირეთ მთელი ხილული დიაპაზონი, დაახლოებით 550-დან 750 nm-მდე, ნაცვლად მხოლოდ ერთ ტალღის სიგრძეზე გაზომვისა. თუ ნორმირებული სპექტრების ფორმა კონცენტრაციასთან ერთად იცვლება, ქიმიური მდგომარეობაც იცვლება და დიაპაზონი ზედმეტად ფართოა.
2. სხვადასხვა დონეზე აკონტროლეთ დაახლოებით 610 nm-ზე აბსორბანსის შეფარდება დაახლოებით 665 nm-ზე აბსორბანსთან. თუ შეფარდება კონცენტრაციასთან ერთად იზრდება, ეს ნიშნავს, რომ დიმერის სპექტრული მხარი ძლიერდება და მონომერული მოდელი აღარ მოქმედებს. ეს დიაგნოსტიკური მიდგომა უფრო დაწვრილებითაა ახსნილი აგრეგაციისა და კონცენტრაციის გავლენის სახელმძღვანელოში.
3. დაბალ მიკრომოლარულ კონცენტრაციებთან მუშაობისთვის გამოიყენეთ 1 cm კიუვეტი. დაახლოებით 82,000 დახრილობისას 5 მიკრომოლარი იძლევა დაახლოებით 0.41 აბსორბანსს, ხოლო 10 მიკრომოლარი — დაახლოებით 0.82-ს; ორივე ხელსაწყოების უმეტესობისთვის მოსახერხებელი მნიშვნელობაა.
4. კონცენტრირებული საწყისი ხსნარებისთვის შეამცირეთ ოპტიკური გზის სიგრძე, ნაცვლად იმისა, რომ 1-ზე გაცილებით მაღალი აბსორბანსი მისაღებად ჩათვალოთ. თუმცა გახსოვდეთ: მოკლე ოპტიკური გზა ფოტომეტრიის პრობლემას აგვარებს და არა ქიმიისას. აგრეგაცია კონცენტრაციაზეა დამოკიდებული და არა ოპტიკური გზის სიგრძეზე, ამიტომ კონცენტრირებულ საწყის ხსნარს მაინც სჭირდება საკუთარი მიდგომა, რომელიც ქიმიური ფორმების განაწილებას ითვალისწინებს, და არა განზავებული მონომერის მრუდი.

ამ სურათის დიდი ნაწილის საფუძვლად არსებული გლობალური მოდელის მორგება მოიცავდა 224 სპექტრს, 1.1 მიკრომოლარიდან 3.4 მილიმოლარამდე, და ტეტრამერის სიგნალი უკვე 34 მიკრომოლარზე დაბალ კონცენტრაციებზე გამოავლინა. ეს შედეგი სიფრთხილისკენ გვიბიძგებს: წრფივი უბანი იმაზე ვიწროა, ვიდრე ინტუიცია გვკარნახობს, ამიტომ გადაამოწმეთ და ნუ მიიღებთ მას თავისთავად მოცემულად.

დონეები, განმეორებითი გაზომვები და თანმიმდევრობა

სამწერტილიანი მრუდი არაფერს ამტკიცებს. ICH Q2(R2)-ის ვალიდაციის მითითებები წრფივობის შესაფასებლად სულ მცირე ხუთ კონცენტრაციას მოითხოვს, ხოლო ექვსიდან რვამდე არანულოვანი დონე უფრო დამაჯერებელ სამუშაო მრუდს იძლევა, განსაკუთრებით ზედა ნაწილში, სადაც აგრეგაცია იწყება. დონეები ისე გაანაწილეთ, რომ ნიმუშების დაგეგმილი დიაპაზონი მოიცვას და მეტი წერტილი იყოს იქ, სადაც გამრუდება ყველაზე მეტადაა მოსალოდნელი; ნუ აირჩევთ გეომეტრიულ პროგრესიას მხოლოდ მოხერხებულობისთვის.

თითოეული დონე გაზომეთ ორჯერ ან სამჯერ, დამოუკიდებლად მომზადებული ხსნარებით და არა ერთი კოლბიდან სამი წაკითხვით. დამოუკიდებელი განმეორებები მომზადების შეცდომას ავლენს; ერთი კოლბიდან განმეორებითი წაკითხვები მხოლოდ ხელსაწყოს ხმაურს აჩვენებს. 2020 წლის გლობალურ კვლევაში თითოეული ხსნარი სამჯერ გაზომეს, რაც კვლავ გონივრული საწყისი მიდგომაა. გაზომვის თანმიმდევრობა შემთხვევითად განსაზღვრეთ, რათა დრეიფმა, მინაზე ადსორბციამ ან ტემპერატურის ცვლილებამ გამრუდების შთაბეჭდილება არ შექმნას. კვარცის კიუვეტების კვლევამ აჩვენა, რომ 34 მიკრომოლარული ხსნარიდან 10 წუთში საღებავის დაახლოებით 3 პროცენტი ადსორბირდებოდა, ამიტომ მთელი გაზომვის სერიის განმავლობაში ერთნაირად შეინარჩუნეთ კონტაქტის დრო, კიუვეტი, გაწმენდის პროცედურა და თანმიმდევრობა.

საილუსტრაციო გამოთვლის მაგალითი (არა გაზომილი მონაცემები)

ქვემოთ მოცემული რიცხვები გამოგონილია გამოთვლების საჩვენებლად. ისინი არ არის ლაბორატორიული გაზომვები და არ უნდა იყოს ციტირებული, როგორც მეთილენის ლურჯის მონაცემები. მნიშვნელოვანია მათთან დაკავშირებული შემოწმებების სქემა.

დავუშვათ, გვაქვს ექვსი სტანდარტი შესაბამის ბუფერში, ოპტიკური გზის სიგრძეა 1 cm და გაზომვა ტარდება 665 nm-ზე შესაბამისი ბლანკის მიმართ:

საშუალო აბსორბანსის კონცენტრაციაზე დამოკიდებულებისთვის სწორი ხაზის მორგება იძლევა დაახლოებით 0.0805 აბსორბანსის ერთეულს თითო მიკრომოლარზე და თავისუფალ წევრს, რომელიც ნულს აბსორბანსის მხოლოდ რამდენიმე მეათასედი ერთეულით სცილდება. დახრილობის ოპტიკური გზის სიგრძეზე გაყოფა მას მოჩვენებით შთანთქმის კოეფიციენტად გარდაქმნის: 0.0805 თითო მიკრომოლარზე უდრის დაახლოებით 80,500 M-1 cm-1-ს, რაც შეესაბამება წყალში მონომერით დომინირებულ ინტერვალს. მთავარი შემოწმების მაჩვენებელი არ არის R-ის კვადრატი, რომელიც ორივე შემთხვევაში შესანიშნავად გამოიყურება. მნიშვნელოვანია ნულთან ახლოს მყოფი თავისუფალი წევრი, უცვლელი A610/A665 შეფარდება S2-დან S5-მდე და ტენდენციის გარეშე განაწილებული ნარჩენი გადახრები. S6-ზე შეფარდების ზრდა რეალური სიგნალია იმისა, რომ ეს დონე უნდა გამოირიცხოს ან 7 მიკრომოლარი ამ მატრიცისა და ხელსაწყოს კომბინაციის დროებით ზედა ზღვრად მოინიშნოს.

უცნობი ნიმუშის იდენტურ პირობებში მიღებული 0.245 მაჩვენებელი პირდაპირ გარდაიქმნება: 0.245-ის გაყოფა 0.0805-ზე თითო მიკრომოლარზე იძლევა დაახლოებით 3.0 მიკრომოლარს, ნიმუშის განზავების ნებისმიერი კოეფიციენტის გამოყენებამდე. შედეგი პირობებთან ერთად წარმოადგინეთ: ტალღის სიგრძე, ოპტიკური გზის სიგრძე, ბლანკის მატრიცა, კალიბრაციის ინტერვალი და თარიღი.

შესავსები საკალიბრაციო სამუშაო ფურცელი

ყოველი ახალი მატრიცისთვის ეს შაბლონი ლაბორატორიულ ჩანაწერში გადაიტანეთ. ერთი მატრიცა, ერთი ფურცელი, ერთი მრუდი.

რეაგენტის ფორმის სტრიქონი აქ აუცილებელია. კომერციული მეთილენის ლურჯი შეიძლება იყოს უწყლო მარილი ან ჰიდრატი, მაგალითად ტრიჰიდრატი, ხოლო არასწორი მოლური მასა ყველა ნომინალურ კონცენტრაციაში შეუმჩნეველ სისტემატურ შეცდომას შეიტანს. საწყისი მასალის სისუფთავისა და სპეციფიკაციებთან შესაბამისობის შემოწმება განხილულია ხარისხისა და კლასის სახელმძღვანელოში.

გადაამოწმეთ დამოუკიდებელი საკონტროლო სტანდარტით

საკალიბრაციო მრუდი საკუთარ შედეგებს თავად არ უნდა ამოწმებდეს. მოდელის მორგების შემდეგ ცალკე აწონილი მასალისგან მომზადებული საწყისი ხსნარიდან მოამზადეთ ერთი საკონტროლო სტანდარტი, მიღებული ინტერვალის შუასთან ახლოს მდებარე კონცენტრაციით, და გაზომეთ როგორც უცნობი ნიმუში. რამდენიმე პროცენტის ფარგლებში თანხვედრა მომზადების ჯაჭვის სანდოობას ადასტურებს; შეუსაბამობა კი საწყის ხსნარზე ან განზავებებზე მიუთითებს და არა ხელსაწყოზე. საკონტროლო სტანდარტის გაზომვა ნიმუშების ყოველ პარტიასთან გაიმეორეთ. თუ მისი მაჩვენებელი იცვლება, მრუდი კი უცვლელია, ნიმუშებზე ეჭვის მიტანამდე სამუშაო ხსნარები ან კიუვეტი შეამოწმეთ. ეს ერთი ჩვევა შეუმჩნეველი შეცდომების უმეტესობას გამოავლენს: უწყლო რეაგენტის ბოთლისთვის ჰიდრატის მოლური მასის გამოყენებას, კალიბრაციიდან გადახრილ მიკროპიპეტს, არასწორი იონური ძალის მქონე ბუფერის მომზადებას. საკონტროლო სტანდარტის აღდგენის მაჩვენებელი სამუშაო ფურცელზე დახრილობის გვერდით ჩაიწერეთ, რათა შემდგომ მკითხველს შეეძლოს დაინახოს, რომ ხაზი შემოწმებული იყო და არა უბრალოდ დახაზული.

არაწრფივობის დიაგნოსტიკური ინტერპრეტაცია

როდესაც მრუდი იხრება, გადახრის ფორმა მიზეზს მიანიშნებს. მაღალი აბსორბანსისას ქვემოთ გამრუდება, უცვლელი სპექტრული ფორმის ფონზე, ხელსაწყოზე მიუთითებს; ხშირად მიზეზია პარაზიტული სინათლე, რომელიც ძლიერი აბსორბანსის მაჩვენებლებს ამცირებს. გამრუდება, რომელსაც 610 nm-ზე მხარის ზრდა ახლავს, ქიმიურ მიზეზზე მიუთითებს: დიმერი და უფრო მაღალი რიგის აგრეგატები მონომერისგან განსხვავებულად შთანთქავს. ბლანკი, რომლის განულებაც ვერ ხერხდება, ან სტანდარტები, რომელთა მაჩვენებლებიც დროთა განმავლობაში მცირდება, ჭურჭელზე მიუთითებს: მინაზე ან კიუვეტებზე ადსორბციაზე, განსაკუთრებით მაშინ, თუ სერიის განმავლობაში კონტაქტის დრო იცვლებოდა. ხოლო წერტილებზე გამავალი მკაფიო სწორი ხაზი, რომელიც მაინც არასწორ შედეგებს იძლევა ნიმუშებისთვის, მატრიცაზე მიუთითებს: ნიმუშები საკალიბრაციო ხსნარებისგან განსხვავდება, ამიტომ მრუდი ნიმუშის მატრიცაში ხელახლა ააგეთ ან სტანდარტული დამატების მეთოდზე გადადით. ყველა შემთხვევაში ააგეთ ნარჩენი გადახრების კონცენტრაციაზე დამოკიდებულების გრაფიკი. შემთხვევითი განაწილება სწორი ხაზის მოდელს ამყარებს; ღიმილის ან მოღუშული რკალის ფორმა კი მას უფრო საიმედოდ უარყოფს, ვიდრე R-ის კვადრატის ნებისმიერი ზღვარი — ამ მიდგომას ვალიდაციის მითითებები პირდაპირ უჭერს მხარს.

მეთილენის ლურჯთან ასეთი დისციპლინა შედეგიანია. მისი მონომერული ზოლი ძლიერია, ქიმიური ქცევა კარგადაა შესწავლილი და პრობლემები სპექტრში თავს იჩენს მანამდე, სანამ რიცხვებს დაამახინჯებს. მრუდი ვიწრო დიაპაზონში ააგეთ, ბლანკი სწორად შეარჩიეთ, განმეორებითი გაზომვები დამოუკიდებლად ჩაატარეთ და დიაპაზონის შერჩევაში სპექტრების ფორმას გადამწყვეტი მნიშვნელობა მიანიჭეთ. მიღებული ხაზი მოკლეა, მაგრამ მასზე ყოველი წერტილი სანდოა.

ამ სტატიაში საილუსტრაციო გამოთვლებისთვის გამოყენებულია გამოგონილი რიცხვები მეთოდის საჩვენებლად. გაზომილი საცნობარო კოეფიციენტები, სრული პირობებით, მოცემულია ბმულით მითითებულ სპექტრულ ცნობარში, ხოლო საფუძვლად გამოყენებული აგრეგაციის კვლევა ინდექსირებულია ნომრით PMID 33251415.