მეთილენის ლურჯი ზებრათევზის კვლევაში: მოვლა-შენახვის დანამატი და ექსპერიმენტული შედეგების შემრევი ფაქტორი

ზებრათევზის ქვირითის წყალი ხშირად ოდნავ ლურჯია და თითქმის არავინ იწერს, რატომ. საღებავი მეთილენის ლურჯია, რომელსაც სოკოს წინააღმდეგ ამატებენ, ხოლო პროტოკოლების უმეტესობა მას ფონურ კომპონენტად მიიჩნევს. აქ „ფონი“ არასწორი ცნებაა. უფრო შესაფერისია აღურიცხავი ექსპერიმენტული ფაქტორი: ნივთიერება, რომელიც დამუშავებულ ჭურჭელში არის, საკონტროლოში კი — არა, გამოყენებულ კონცენტრაციებზე ფარმაკოლოგიურად აქტიურია და შეუძლია შეცვალოს სწორედ ის საბოლოო მაჩვენებლები, რომლებსაც ექსპერიმენტი ზომავს.

ეს განსხვავება ქვემოთ განხილულ ყველაფერს განსაზღვრავს. სოკოს საწინააღმდეგო რუტინული მოვლა-შენახვა ერთი საკითხია. ნეიტრალურია თუ არა დანამატი თქვენი ტესტისთვის — სხვა. ზებრათევზის შესახებ ბოლო წლების სამეცნიერო ლიტერატურა პირველ კითხვას დამაიმედებლად პასუხობს, მეორეს კი — შემაშფოთებლად.

რას ითვალისწინებს სახელმძღვანელოები სინამდვილეში

ერთიანი სტანდარტი არ არსებობს და პრობლემის ნაწილი სწორედ ესაა. ცხოველთა მოვლის კანადის საბჭოს მითითებები სოკოს ზრდის შესამცირებლად ქვირითისა და ლარვების სატრანსპორტო ხსნარში 0.5 mg/L-ს, ანუ 0.00005%-ს უშვებს. ევროპული მითითებები ლაბორატორიული ცხოველების შესახებ აღწერს ემბრიონების შენახვას არეში, რომელიც ხშირად იმავე 0.00005%-ს შეიცავს. Cold Spring Harbor-ის E3-ის რეცეპტი ინგრედიენტად ორჯერ მეტს — 1 mg/L-ს, ანუ 0.0001%-ს — განსაზღვრავს. ამ ფონზე თვალსაჩინოა ერთი გამოტოვება: OECD-ის თევზის ემბრიონებზე ტოქსიკურობის ტესტის სახელმძღვანელო განსაზღვრავს აღდგენილი შემადგენლობის გამაზავებელ წყალსა და გამოსაცდელ ქიმიურ ნივთიერებას, მაგრამ მეთილენის ლურჯს არც 2013 წლის ვერსიაში და არც მოგვიანებით შესწორებულ ვერსიაში არ ურჩევს. ასე რომ, ერთი ლაბორატორია ზებრათევზის ემბრიონებს სიცოცხლის პირველივე საათებიდან მეთილენის ლურჯით შეფერილ წყალში ზრდის, მეორე კი მარეგულირებელ ემბრიონულ ტესტს უფერო წყალში ატარებს და ორივე თავის არეს ნორმალურად მიიჩნევს. ვინც ლაბორატორიებს შორის შედეგებს ადარებს ან წარსული კვლევების საკონტროლო მონაცემებს აერთიანებს, ამ შეუსაბამობასაც იღებს.

კონცენტრაციების უკეთ გასაგებად: 0.00005% დაახლოებით 1.56 მიკრომოლარულია, ხოლო 0.0001% — დაახლოებით 3.13 მიკრომოლარული. ეს დაბალი რიცხვებია და ადვილია მათი იმდენად მცირედ მიჩნევა, რომ მნიშვნელობა არ ჰქონდეს. ქვემოთ განხილული კვლევები სწორედ ამ ვარაუდს ამოწმებს, ზუსტად ამ კონცენტრაციებზე.

მკითხველები, რომლებიც ლაბორატორიის ნაცვლად აკვარიუმის თევზების მოვლის სფეროდან მოდიან, იმავე მოლეკულას სხვა გარემოში ხვდებიან; ეს გარემო განხილულია მეთილენის ლურჯის აკვარიუმში გამოყენების გზამკვლევში. ქიმია საერთოა; განხილვა იმისა, თუ როგორ გადააქვს საღებავს ელექტრონები უჯრედებში, ხსნის, რატომ გვხვდება რედოქსაქტიური ნაერთი ასე ხშირად მეტაბოლიზმის შესახებ ნაშრომებში. ქვემოთ განხილული საკითხები კონკრეტულად მეთილენის ლურჯის შემცველ ზებრათევზის ქვირითის წყალს ეხება.

მეტაბოლიზმი: ეფექტი განვითარების ეტაპის მიხედვით მიმართულებას იცვლის

ყველაზე ინფორმაციულ კვლევაში ნორმალურად განვითარებადი ზებრათევზები სიცოცხლის პირველი დღიდან განაყოფიერების შემდგომ 5 დღემდე მეთილენის ლურჯის ზემოქმედების ქვეშ იყვნენ და ყოველ ეტაპზე მათი ჟანგვითი მეტაბოლიზმი იზომებოდა, როგორც ამას ემბრიონების მეტაბოლიზმის ექსპერიმენტების გამოქვეყნებული ანგარიში აღწერს. შედეგების სურათი ყურადღებით უნდა გადმოიცეს, რადგან ეფექტის მიმართულება იცვლება.

განაყოფიერებიდან 1 დღის შემდეგ ექსპოზიციაში მყოფ ემბრიონებში ჟანგბადის ბაზალური მოხმარება მოვლა-შენახვისთვის გამოყენებულ ორივე კონცენტრაციაზე გაიზარდა. 2 დღის შემდეგ ლარვების ზედაპირულ შრეში მიტოქონდრიული მემბრანის პოტენციალი მომატებული იყო 0.00005%, 0.0001% და 0.0003% კონცენტრაციების ზემოქმედებისას. 4-დან 5 დღემდე, გამოჩეკვის შემდეგ, მიმართულება შეიცვალა: ჟანგვითი ენერგოდანახარჯი შემცირდა იმის მიუხედავად, ექსპოზიცია განაყოფიერებიდან უწყვეტად მიმდინარეობდა თუ მხოლოდ მე-3 დღიდან მე-4 დღემდე იყო მწვავე. პარალელურად, როგორც 1, ისე 4 დღის შემდეგ შემცირდა მიტოქონდრიული სასუნთქი კომპლექსების ქვედანაყოფების ტრანსკრიპტების რაოდენობა, სტეროიდოგენეზსა და გლუკონეოგენეზთან დაკავშირებულ ტრანსკრიპტებთან ერთად.

კიდევ ორი დაკვირვება სურათს აზუსტებს. მოვლა-შენახვისთვის გამოყენებულ უფრო მაღალ კონცენტრაციაზე გამოჩეკვა ოდნავ ადრე მიმდინარეობდა: ექსპოზიციაში მყოფი ემბრიონები 2 დღის შემდეგ წინ იყვნენ, საკონტროლო ჯგუფი კი მათ მე-3 დღისთვის დაეწია. ამასთან, თავად სტრესის ღერძი შენარჩუნებული ჩანდა: როცა 5 დღის ლარვებზე მბრუნავი მოძრაობით გამოწვეული სტრესორი მოქმედებდა, მთელ სხეულში კორტიზოლის დონე ორივე ჯგუფში ჩვეულებრივ იმატებდა. ამგვარად, ამ დოზებზე საღებავი განვითარებისთვის ზოგად შხამს არ წარმოადგენს და ყველა ფიზიოლოგიურ პასუხს არ თრგუნავს. ის ენერგეტიკულ მეტაბოლიზმს განვითარების ეტაპზე დამოკიდებულად ცვლის: გამოჩეკვამდე ზრდის, შემდეგ კი ამცირებს.

ქცევა: რატომ განსხვავდება ორი კვლევის შედეგები და რატომ შეიძლება ორივე სწორი იყოს

ქცევითი კვლევების შედეგები ურთიერთსაწინააღმდეგო ჩანს, სანამ ექსპოზიციის სქემებს გვერდიგვერდ არ განვიხილავთ. ერთმა განვითარებისა და ქცევის უსაფრთხოების კვლევამ ემბრიონებზე განაყოფიერებიდან დაახლოებით 6 საათის შემდეგ დაიწყო ზემოქმედება, 10 მიკრომოლარულამდე კონცენტრაციებით; ხსნარებს ყოველდღე, მე-4 დღის ჩათვლით, აახლებდნენ, შემდეგ ლარვები მე-5 და მე-6 დღეებისთვის საღებავისგან თავისუფალ არეში გადაიყვანეს და მე-6 დღეს ნათელი–ბნელი პირობების ტესტში ლოკომოცია შეამოწმეს. შედეგი: სიკვდილიანობაზე, გამოჩეკვასა თუ მორფოლოგიაზე მნიშვნელოვანი გავლენა არ გამოვლენილა და არც დამუშავებას ჰქონია გავლენა ლოკომოციაზე. ავტორებმა თავიანთი პირობებისთვის ზედა ზღვრად 10 მიკრომოლარული გონივრულად მიიჩნიეს.

მეორე ჯგუფმა, რომლის ავტორების ნაწილიც მეტაბოლიზმის კვლევაშიც მონაწილეობდა, ექსპოზიცია ისე ჩაატარა, როგორც მოვლა-შენახვისას რეალურად ხდება: საღებავი განაყოფიერებიდან 2-დან 3 საათამდე პერიოდში დაამატეს, ყოველდღიურად ნაწილობრივ აახლებდნენ, ქცევას კი მაშინ ზომავდნენ, როცა ექსპოზიცია ჯერ კიდევ მიმდინარეობდა ან ახლახან იყო დასრულებული. იმავე რუტინულ კონცენტრაციებზე ლარვებში 24-საათიან ტესტში ლოკომოციის შემცირება გამოვლინდა, რაც სხვადასხვა ხაზსა და ლაბორატორიაში განმეორდა. ქცევითი შედეგების შერევის კვლევამ ეფექტი სეროტონერგულ ტონუსს დაუკავშირა, რაც შეესაბამება საღებავის ცნობილ უნარს, დათრგუნოს მონოამინოქსიდაზა. ყველაზე საყურადღებო ის იყო, რომ მეთილენის ლურჯის შემცველმა ემბრიონულმა არემ შენიღბა SSRI ფლუოქსეტინზე მოსალოდნელი ლოკომოტორული პასუხი. შესაბამისად, ლურჯ წყალში ჩატარებულმა სკრინინგულმა ტესტმა შეიძლება ვერ გამოავლინოს წამლის ეფექტი, რომელიც უფერო წყალში გამოჩნდებოდა.

რეალური წინააღმდეგობა არ არსებობს. ნაერთმა შეიძლება ერთ ტესტში გამორეცხვიდან ორი დღის შემდეგ ეფექტის შესამჩნევი კვალი აღარ დატოვოს, ხოლო მეორეში, სანამ არეშია, კვლავ აქტიური იყოს. პრაქტიკული დასკვნა ასეთია: ნულოვანი შედეგი კონცენტრაციის ზედა ზღვრის დასადგენად გამოდგება და არა ნეიტრალურობის დასამტკიცებლად; დადებითი შედეგი კი სწორედ მნიშვნელოვან რისკს აღწერს — აქტიურ ექსპოზიციას გაზომვის პერიოდში, ზუსტად იმ სქემით, რომელსაც ლაბორატორიების უმეტესობა იყენებს.

რედოქსსაღებავი რედოქსტესტში

კიდევ ერთი საფრთხე ცალკე აბზაცს იმსახურებს, რადგან ის ცხოველის ნაცვლად გაზომვის საშუალებას ამახინჯებს. ენერგოდანახარჯის Alamar Blue ტესტი თავადაც რედოქსქიმიას ეფუძნება: რეზაზურინი ფლუორესცენტულ რეზორუფინად აღდგება. მეთილენის ლურჯიც რედოქსქიმიაში მონაწილეობს. უჯრედების გარეშე საკონტროლო ცდებში მოვლა-შენახვისთვის გამოყენებულმა ორივე კონცენტრაციამ 24 საათის შემდეგ Alamar Blue-ის ფლუორესცენცია მცირედ, მაგრამ სტატისტიკურად მნიშვნელოვნად შეამცირა. ცხოველებზე ექსპერიმენტებში ექსპოზიციაში მყოფ ემბრიონებს ტესტამდე საღებავისგან თავისუფალ არეში სულ მცირე სამჯერ რეცხავდნენ, ხოლო გამოჩეკილ ლარვებში ბიოლოგიური ეფექტი უჯრედების გარეშე გამოვლენილ ხელისშემშლელ ეფექტს აღემატებოდა. ამიტომ ორივე დებულება მართებულია: გარეცხილ ცხოველებში რეალური მეტაბოლური ეფექტი რჩება, ხოლო ჩამოურეცხავი საღებავი მას პირდაპირ ქიმიურ არტეფაქტს ამატებს. საკონტროლო პირობებმა ეს ორი ეფექტი უნდა გამიჯნოს, წინააღმდეგ შემთხვევაში არც ერთ რიცხვს არ ექნება აზრი. ზოგადი მითითებები საღებავზე დაფუძნებული ტესტების შედეგების ინტერპრეტაციის შესახებ აქ განსაკუთრებით მნიშვნელოვანია.

განვითარების ეტაპების ქრონოლოგია

ამ სტატიისთვის შექმნილი ორიგინალური მასალა. თუ სხვაგვარად არ არის მითითებული, კონცენტრაციებია მოვლა-შენახვის ორი სტანდარტული მნიშვნელობა — 0.00005% და 0.0001%.

დასამახსოვრებელი სურათი ასეთია: მეტაბოლური მაჩვენებლები თავდაპირველად იზრდება, მოგვიანებით კი მცირდება; ქცევითი ეფექტები ექსპოზიციისას ვლინდება, ხოლო იმ ერთადერთ ტესტში, რომელმაც გამორეცხვის შემდეგ მდგომარეობა შეამოწმა, ისინი აღარ გამოვლენილა.

საკონტროლო პირობების დაგეგმვის საკონტროლო სია

მეორე ორიგინალური მასალა. გამოიყენეთ მაშინ, როცა ზებრათევზის მოვლის პროტოკოლები, რომლებიც მეთილენის ლურჯს მოიცავს, ექსპერიმენტს უკავშირდება.

1. საღებავი აღრიცხეთ როგორც რეაგენტი და არა როგორც წყალი. მიუთითეთ კონცენტრაცია როგორც პროცენტებში, ისე მიკრომოლარულად, ექსპოზიციის დაწყება და დასრულება განაყოფიერების შემდგომ საათებში ან დღეებში, განახლების განრიგი და თითოეულ გაზომვამდე გამორეცხვის ინტერვალი.
2. საკონტროლო პირობები კვლევის კითხვას შეუსაბამეთ. გამოსაცდელი ქიმიური ნივთიერების კვლევას საღებავისგან თავისუფალი საკონტროლო პირობები სჭირდება; მოვლა-შენახვის კვლევას კი — საღებავის გარეშე და საღებავით ჯგუფების შედარება და სოკოს საწინააღმდეგო შედეგის აღრიცხვა, რადგან არც ერთ ციტირებულ კვლევაში სოკოს საწინააღმდეგო ეფექტურობა არ გაზომილა.
3. რედოქსტესტებამდე გარეცხეთ, შემდეგ კი გადაამოწმეთ. სულ მცირე სამჯერ გაავლეთ საღებავისგან თავისუფალ არეში და პარალელურად ჩაატარეთ უჯრედების გარეშე საკონტროლო ცდა საღებავითა და რეაგენტით, რადგან საღებავი Alamar Blue-ის სიგნალს პირდაპირ ამცირებს.
4. ქცევითი და მონოამინური მაჩვენებლები მაღალი რისკის მქონედ მიიჩნიეთ. ლოკომოციის, შეშინების რეაქციის, შფოთვისმაგვარი ქცევის, ანტიდეპრესანტებისა და MAO-ის ინჰიბიტორების კვლევებში გაზომვისას საღებავს უნდა მოერიდოთ ან კონკრეტული მაჩვენებლის მიმართ მისი ნეიტრალურობა აჩვენოთ; ერთიდან ორ დღემდე გამორეცხვამ ერთი ლოკომოტორული ეფექტი გააქრო, თუმცა სხვა ექსპერიმენტული სქემებისთვის ეს დადასტურებული არ არის.
5. მეტაბოლური და მიტოქონდრიული მაჩვენებლები ყველა ეტაპზე მაღალი რისკის მქონედ მიიჩნიეთ. ჟანგბადის მოხმარება, ენერგოდანახარჯი, მემბრანის პოტენციალი და სასუნთქი ჯაჭვის ტრანსკრიპტები მოვლა-შენახვის კონცენტრაციებზე იცვლება, გამოჩეკვამდე და მის შემდეგ — საპირისპირო მიმართულებით.
6. ერთი ექსპერიმენტული სქემის ნეიტრალურობის დასკვნა სხვაზე არ გადაიტანოთ. გამორეცხვის შემდეგ მიღებული ნულოვანი შედეგი მიმდინარე ექსპოზიციაზე არ ვრცელდება; მორფოლოგიაზე ეფექტის არქონა მეტაბოლიზმსა თუ წამალთან ურთიერთქმედებაზე ეფექტის არქონას არ ნიშნავს; ერთ ხაზში, ტემპერატურაზე ან ტესტის ხანგრძლივობაზე მიღებული შედეგი სხვებზე არ ვრცელდება.
7. მიუთითეთ, რომელ სახელმძღვანელოს მიჰყევით და რა ალტერნატივა არსებობს. მკაფიოდ დაასახელეთ CCAC-ის, ევროპული ან Cold Spring Harbor-ის კონცენტრაციები და აღნიშნეთ, რომ OECD-ის ემბრიონულ ტესტში საღებავი არ არის გათვალისწინებული, რათა მკითხველმა თქვენი ცხოველების პირობების შეფასება შეძლოს.

ეს ყველაფერი არ ნიშნავს, რომ ქვირითის სიცოცხლის შესანარჩუნებლად საღებავი არ უნდა გამოიყენოთ. ეს ნიშნავს, რომ მოვლა-შენახვისას გაკეთებული არჩევანი მონაცემებზე გაუთვალისწინებლად არ უნდა აისახოს. ჭურჭელში არსებული ლურჯი ფერი ფარმაკოლოგიური თვისებების მქონე მოლეკულას ეკუთვნის, ხოლო დამახინჯების ყველაზე მაღალი რისკი სწორედ იმ მაღალი გამტარუნარიანობის მეტაბოლურ და ნეიროქცევით სკრინინგებს აქვს, რომლებისთვისაც დღეს ახალგაზრდა ზებრათევზებს ანიჭებენ უპირატესობას. აღრიცხეთ ის, გააკონტროლეთ, გაზომვამდე გამორეცხეთ და გადაამოწმეთ ტესტი, რომელშიც ის შესაძლოა შეუმჩნევლად მონაწილეობდეს.