საფუარის ანალიზები მეთილენის ლურჯით: ცოცხალი უჯრედების დათვლა და სუნთქვის დროის გაზომვა

ლაბორატორიულ მაგიდაზე ორი სინჯარა დგას. ორივე ლურჯია. ერთ შემთხვევაში მიკროსკოპში დანახული ლურჯი უჯრედები მკვდარ საფუარს ნიშნავს. მეორე შემთხვევაში კი სინჯარის ლურჯიდან უფერულად ქცევა ნიშნავს, რომ საფუარი ცოცხალია და სუნთქავს. საღებავი ერთია, მაგრამ შედეგების მნიშვნელობა — საპირისპირო. თუ ამ ორ ანალიზს ერთმანეთში აურევთ, ყველა დასკვნა საპირისპიროდ შეიცვლება.

მთელი სტატია სწორედ ამ განსხვავებას ეხება. მეთილენის ლურჯი ჟანგვა-აღდგენითი საღებავია: დაჟანგულ მდგომარეობაში ლურჯია, აღდგენილ მდგომარეობაში კი უფერული ლეიკომეთილენის ლურჯი ხდება. სიცოცხლისუნარიანობის დათვლისას ამ ქიმიურ თვისებას ხანმოკლე მიკროსკოპული დაკვირვებისთვის იყენებენ. სუნთქვის ექსპერიმენტში კი — მთელ მოცულობაში მიმდინარე რეაქციის დროის გასაზომად. თითოეულს თავისი პროტოკოლი, თავისი საკონტროლო ნიმუშები და თავისი კრიტიკული შეფასება სჭირდება.

სიცოცხლისუნარიანობის დათვლა: ხანმოკლე შეღებვა და სწრაფი შეფასება

ლუდის წარმოებაში გამოყენებული პროტოკოლი ყველაზე სტანდარტიზებული ვარიანტია. მოამზადეთ 0.01% w/v მეთილენის ლურჯი 2% ნატრიუმის ციტრატში, შეურიეთ საფუარის სუსპენზიას 1:1 თანაფარდობით და ნარევი ხანმოკლე, წინასწარ განსაზღვრული ინტერვალის შემდეგ შეისწავლეთ. გამოქვეყნებული ინტერვალები განსხვავდება: ლუდის წარმოების მეცნიერების ინსტიტუტის სახელმძღვანელოში მითითებულია 1-დან 2 წუთამდე, კვლევით პროტოკოლებში — დაახლოებით 5 წუთი, ხოლო OIV-ის ღვინის მიკრობიოლოგიის მეთოდი მოითხოვს შეფასებას 10 წუთის განმავლობაში. დასათვლელ ნარევში საღებავის საბოლოო კონცენტრაცია დაახლოებით 0.005% გამოდის. შეავსეთ გაუმჯობესებული ნოიბაუერის კამერა და დაახლოებით 400x გადიდებაზე მუქი ლურჯი უჯრედები არასიცოცხლისუნარიანად, ხოლო შეუღებავი უჯრედები სიცოცხლისუნარიანად მიიჩნიეთ. OIV-ის მეთოდში ღია ლურჯი უჯრედები ცოცხლად ითვლება, რაც უკვე მიანიშნებს ქვემოთ განხილულ სუბიექტურობის პრობლემაზე.

უჯრედების კონცენტრაცია კამერის გეომეტრიიდან გამოითვლება. როდესაც ცენტრალურ 1 mm კვადრატს მთლიანად ითვლით, უჯრედების რაოდენობა ერთ mL-ში უდრის N-ს, გამრავლებულს განზავების კოეფიციენტსა და 10^4-ზე, სადაც N ამ ფართობზე დათვლილი უჯრედების რაოდენობაა, როგორც აღწერილია ASBC-ის საფუარის მეთოდებში. სიცოცხლისუნარიანობის გამოთვლა უფრო მარტივია: შეუღებავი უჯრედების რაოდენობა იყოფა უჯრედების საერთო რაოდენობაზე და მრავლდება 100-ზე. სიცოცხლისუნარიანობის შესაფასებლად დაითვალეთ დაახლოებით 400 უჯრედი, FEMS-ის ლუდის წარმოების შედარებითი კვლევისა და OIV-ის პრაქტიკის შესაბამისად. საზღვარზე მოხვედრილი უჯრედებისთვის თანმიმდევრულად გამოიყენეთ ერთი წესი: მაგალითად, ჩათვალეთ ბადის ქვედა და მარცხენა ხაზებზე მდებარე უჯრედები, ზედა და მარჯვენა ხაზებზე მდებარეები კი გამორიცხეთ.

კვირტების დათვლის წესი დათვლის დაწყებამდე უნდა განსაზღვროთ. გავრცელებული წესის მიხედვით, კვირტი ცალკე უჯრედად ითვლება, როდესაც დედა უჯრედის ზომის დაახლოებით ნახევარს აღწევს; უფრო პატარა კვირტი კი დედა უჯრედთან ერთად ითვლება. რომელი წესიც უნდა აირჩიოთ, გამოიყენეთ იგი ყველა კვადრატში და ჩაწერეთ სამუშაო ფურცელზე, რათა მომდევნო შემსრულებელმაც იგივე გაიმეოროს.

დათვლის სამუშაო ფურცელი (ამობეჭდეთ)

ეს სამუშაო ფურცელი სპეციალურად ამ სტატიისთვის შექმნილი ორიგინალური მასალაა. გადაიტანეთ რვეულში ან თითოეული ნიმუშისთვის ერთი ეგზემპლარი ამობეჭდეთ.

სიცოცხლისუნარიანობა (%) = 100 x შეუღებავი / (შეუღებავი + მუქი ლურჯი). უჯრედების საერთო რაოდენობა ერთ mL-ში = N x განზავების კოეფიციენტი x 10^4, სადაც N კამერის განსაზღვრულ ფართობზე დათვლილი უჯრედების რაოდენობაა. შედეგის გვერდით ჩაიწერეთ შეღებვის ინტერვალი, რადგან დროის მითითების გარეშე სიცოცხლისუნარიანობის მაჩვენებელი განმეორებადი არ არის.

რატომ იცვლება სიცოცხლისუნარიანობის მაჩვენებლები

დრო პირველი ხელშემშლელი ფაქტორია და მისი გავლენა ორმხრივია. მეტაბოლურად აქტიური უჯრედები საღებავს აღადგენს, ამიტომ ნაადრევი შეფასებისას შეიძლება ცოცხალი უჯრედები აღდგენის დასრულებამდე ნახოთ და შეცდომით მკვდრად ჩათვალოთ. თუმცა ხანგრძლივი ზემოქმედება თავად არის ტოქსიკური და რეალურად დაზიანებულ ლურჯ უჯრედებს წარმოქმნის, რის გამოც შეღებვა საწყისი მდგომარეობის მცდარ სურათს იძლევა. ამიტომ ლაბორატორიული სასწავლო პროტოკოლი შეფასებას 5 წუთის განმავლობაში მოითხოვს, როგორც აღწერილია ვისკონსინის საფუარის სასწავლო პროტოკოლში. სიფრთხილით ჩამოყალიბებული დასკვნა ასეთია: მეთილენის ლურჯით შეფასება დროზეა დამოკიდებული, ამიტომ შეარჩიეთ ერთი ხანმოკლე ინტერვალი და სერიის ყველა ნიმუშისთვის უცვლელად გამოიყენეთ.

დაბალი სიცოცხლისუნარიანობის მქონე ნიმუშებს მეორე ტიპის ცდომილება ახლავს. სტანდარტიზებული მეთოდი აფრთხილებს, რომ დაახლოებით 80%-ზე დაბალი სიცოცხლისუნარიანობისას მეთილენის ლურჯმა შეიძლება რეალური მაჩვენებელი გადაჭარბებულად შეაფასოს, რადგან უჯრედებს, რომლებიც ჯერ კიდევ აღადგენს საღებავს, გამრავლების უნარი შესაძლოა აღარ ჰქონდეს. ლუდის წარმოების ლიტერატურაშიც აღწერილია იგივე არასანდოობა სიცოცხლისუნარიანობის მნიშვნელოვანი დაქვეითებისას. მეთილენის ლურჯით მიღებული შედეგი სწრაფ, მიახლოებით შეფასებად მიიჩნიეთ და დაბალი სიცოცხლისუნარიანობისას მნიშვნელოვანი გადაწყვეტილებები, მაგალითად კულტურის ხელახლა გამოყენება საფუარის შესატანად, საკვებ არეზე დათვლით ან დამატებითი საღებავით გადაამოწმეთ.

მესამეა მატრიცის ეფექტები. OIV-ის მეთოდი დაახლოებით pH 4.6-ზე ტარდება და აფრთხილებს, რომ ძლიერი ბუფერული უნარის მქონე დაბალი pH-ის ნიმუშები საღებავის სათანადო ქცევას უშლის ხელს. მეთოდი ასევე არ გირჩევთ ანალიზის ჩატარებას 100 g/L-ზე მეტი შაქრის შემცველობისას, რადგან ასეთ პირობებში უჯრედები შეცდომაში შემყვან ღია ლურჯ შეფერილობას იძენს. შეღებვის pH-ის ექსპერიმენტულმა შედარებამ შესწავლილ დიაპაზონში მგრძნობელობის მნიშვნელოვანი ცვლილება გამოავლინა, რაც შეესაბამება მეთილენის ლურჯის მეთოდის pH-ზე დამოკიდებულების კვლევას. ნარჩენები ცალკე საფრთხეა: მინარევებით მდიდარ დურდოში შეღებილი ნაწილაკები მკვდარ უჯრედებს ჰგავს და სხვადასხვა შემსრულებლის შედეგებს შორის სხვაობას ზრდის.

ეს ცვალებადობა რაოდენობრივადაა შეფასებული და მხოლოდ ცალკეულ დაკვირვებებს არ ეფუძნება. FEMS-ის საფუარის შედარებით კვლევაში აღწერილ ექვსთვიან საწარმოო ცდაში მეთილენის ლურჯით დუბლირებული გაზომვების სტანდარტული გადახრა საშუალოდ 6.1% იყო, ოქსონოლის ნაკადური ციტომეტრიის 0.2%-თან შედარებით; ორი შემსრულებლის შედეგები ერთსა და იმავე ნიმუშზე 13 პროცენტულ პუნქტამდე განსხვავდებოდა. სიცოცხლისუნარიანობის მეთოდების 2023 წლის რაოდენობრივმა შედარებამ აჩვენა, რომ ფლუორესცენტული მიკროსკოპია და ნაკადური ციტომეტრია მნიშვნელოვნად უფრო ზუსტია, თუმცა მეთოდის შედეგიანობა სახეობასა და მატრიცაზეა დამოკიდებული. პეინტინგისა და კირსოპის მეთოდის კლასიკური აღწერა (PMID 24430080) კვლავ ძირითად საცნობარო წყაროდ რჩება, ხოლო უფრო ფართო საფუარის სიცოცხლისუნარიანობისა და მეტაბოლური აქტივობის ანალიზების მიმოხილვა (PMID 25154541) მეთილენის ლურჯს დამატებით და არა საბოლოო პასუხის მომცემ ტესტებს მიაკუთვნებს. ტრიპანის ლურჯი აქ ავტომატურად უკეთესი ალტერნატივა არ არის: ის მემბრანის მთლიანობის დაკარგვას ასახავს, მეთილენის ლურჯი კი — უჯრედში შეღწევასა და აღმდგენ აქტივობას ერთად, ამიტომ სტრესის ქვეშ მყოფი უჯრედები ამ ორი საღებავით შეიძლება სხვადასხვაგვარად კლასიფიცირდეს.

სუნთქვის ექსპერიმენტი: გაზომეთ ლურჯი ფერის გაქრობის დრო

მეორე ანალიზში მიკროსკოპი საერთოდ არ გამოიყენება. საფუარი, გლუკოზა და განზავებული მეთილენის ლურჯი დახურულ სინჯარაში თავსდება, ხოლო საათით იზომება, რამდენ ხანში გაქრება ლურჯი ფერი. მეტაბოლიზმისას უჯრედები წარმოქმნის აღმდგენ ეკვივალენტებს, რომლებიც ლურჯ საღებავს უფერულ ფორმად გარდაქმნის, ხოლო გახსნილი ჟანგბადი მას კვლავ ჟანგავს. როგორც კი უჯრედები ჟანგბადის რაოდენობას შეამცირებს, აღდგენა ჭარბობს და სინჯარა უფერულდება. ამგვარად, საბოლოო წერტილი ასახავს სუნთქვის, საღებავის კონცენტრაციისა და ჟანგბადის ხელმისაწვდომობის ბალანსს. იგი უნდა აღირიცხოს, როგორც მეთილენის ლურჯის აღდგენის ან გაუფერულების დრო და არა როგორც მოლეკულური ჟანგბადის მოხმარების უშუალო სიჩქარე.

გამოიყენეთ გაცილებით უფრო განზავებული საღებავი, ვიდრე სიცოცხლისუნარიანობის შეფასებისას, რათა გაზომილი დრო მოსახერხებელ დიაპაზონში მოხვდეს. AQA-ის A დონის სავალდებულო პრაქტიკული სამუშაოების სახელმძღვანელო ამას კარგად ასტანდარტებს: 1 g გლუკოზა დაახლოებით 30 C-მდე შემთბარ 100 mL წყალში, უშუალოდ გამოყენებამდე დამატებული 5 g მშრალი საფუარი და დაახლოებით 0.001% სამუშაო საღებავი, რომელიც მზადდება 1% საწყისი ხსნარის 0.1 mL-ის 100 mL-მდე განზავებით. შეურიეთ საფუარისა და გლუკოზის სუსპენზიის 2 mL სამუშაო საღებავის 2 mL-ს, მიიყვანეთ საცდელ ტემპერატურამდე, ერთხელ შეანჯღრიეთ 10 წამის განმავლობაში, ჩართეთ წამზომი და აღარ შეანჯღრიოთ. შენჯღრევა ჟანგბადს ხელახლა შეიტანს და სინჯარას კვლავ ალურჯებს — ეს ყველაზე მნიშვნელოვანი პროცედურული არტეფაქტია. AQA აღნიშნავს, რომ მომზადებული ნარევი ჩვეულებრივ დაახლოებით 5 წუთში უნდა გაუფერულდეს 35 C-ზე; ცდების საშუალო დროებია 275 s 20 C-ზე, 128 s 35 C-ზე და 145 s 45 C-ზე. ეს ერთი კონკრეტული სქემის მაგალითებია და არა უნივერსალური საორიენტაციო მაჩვენებლები. კონტროლირებულ პირობებში აღდგენის სიჩქარესა და მეტაბოლურად აქტიურ საფუარს შორის რაოდენობრივ კავშირს ადასტურებს აღდგენის სპეციალიზებული კვლევები, მათ შორის PMID 25773544-ით ინდექსირებული ნაშრომი და მექანიზმის კვლევა ჟურნალში Yeast (2014).

დროითი დინამიკის დემონსტრაცია (ორიგინალური მასალა)

ქვემოთ მოცემული ცხრილი ამ სტატიისთვის შექმნილი ორიგინალური დემონსტრაციაა, რომელიც ზემოთ აღწერილ AQA-ს ტიპის სქემას იყენებს: საფუარისა და გლუკოზის ნარევის 2 mL და დაახლოებით 0.001% სამუშაო საღებავის 2 mL, ერთი 10-წამიანი შენჯღრევა, შემდეგ კი ინკუბაცია შეხების გარეშე. ჩანაწერები საილუსტრაციო შედეგებია იმ ფორმატში, რომლითაც სტუდენტურმა ჯგუფმა უნდა აწარმოოს აღრიცხვა; სიჩქარის ინდექსი განისაზღვრება, როგორც 1 გაყოფილი გაუფერულების დროზე წამებში. ჩაატარეთ ცდა იმავე სინჯარებით და ეს ჩანაწერები გაზომილი მნიშვნელობებით ჩაანაცვლეთ.

A, B და C სინჯარებისთვის გრაფიკზე ასახეთ სიჩქარის ინდექსის დამოკიდებულება ტემპერატურაზე. მრუდი ჯერ იზრდება, შემდეგ კი სწორდება ან ეცემა — ეს ფერმენტული პროცესისთვის მოსალოდნელი ფორმაა და არა სწორი ხაზი. D, E და F სინჯარები ამ მრუდის მონაცემთა წერტილები არ არის. ისინი საკონტროლო ნიმუშებია, რომლებიც მრუდის ინტერპრეტაციას შესაძლებელს ხდის.

საკონტროლო ნიმუშები და პირობები, რომლებიც თითოეულ ანალიზს მნიშვნელობას სძენს

სუნთქვის ყოველი ცდა სამ თანმხლებ საკონტროლო ნიმუშს საჭიროებს. ადუღებული ან დახოცილი საფუარი გლუკოზასა და საღებავთან ერთად ლურჯი უნდა დარჩეს, რაც ადასტურებს, რომ სწრაფი აღდგენა ცოცხალ მეტაბოლიზმზეა დამოკიდებული. ცოცხალი საფუარი საღებავთან ერთად, დამატებული გლუკოზის გარეშე, სუბსტრატის საკონტროლო ნიმუშია, თუმცა ნელ გაუფერულებას მაინც უნდა ელოდოთ, რადგან საფუარი შიდა მარაგებს მოიხმარს. გლუკოზა და საღებავი საფუარის გარეშე ქიმიური ცარიელი საკონტროლო ნიმუშია. ის აუცილებელია, რადგან ტუტე პირობებში გლუკოზას უჯრედების გარეშეც შეუძლია მეთილენის ლურჯის აღდგენა.

სიცოცხლისუნარიანობის დათვლას სხვა ტიპის კონტროლი სჭირდება: პროცედურის უცვლელობა. გამოიყენეთ საღებავის იგივე საწყისი ხსნარი, შერევის იგივე თანაფარდობა, შეღებვის იგივე ინტერვალი, კამერის იგივე ფართობი და კვირტებისა და საზღვარზე მოხვედრილი უჯრედების დათვლის იგივე წესები; შეძლებისდაგვარად დათვალეთ ბრმა მეთოდით. როდესაც ორი შემსრულებლის შედეგებს შორის ათი პუნქტის სხვაობაა, სამუშაო ფურცელი ჩვეულებრივ მიზეზს ავლენს: განსხვავებულ დროს, ლურჯი შეფერილობის განსხვავებულ ზღვარს ან კვირტების დათვლის განსხვავებულ წესებს. შეღებილი უჯრედების მომზადებისა და დათვალიერების ტექნიკა დაკავშირებულია ბაქტერიების მარტივი შეღებვის მეთოდებთან, ხოლო სხვადასხვა ნიმუშში საღებავით მონიშნული სტრუქტურების უფრო ფართო მიმოხილვა მოცემულია მიკროსკოპული შეღებვის ატლასში. ლურჯი ფერის ინტენსივობის ნებისმიერი რაოდენობრივი შეფასების ფიზიკური საფუძვლებისთვის, პირობების მითითებით წარმოდგენილი შთანთქმის საცნობარო მასალა განმარტავს, რატომ უნდა ახლდეს თითოეულ კოეფიციენტს მისი გამხსნელის, pH-ისა და კონცენტრაციის პირობები.

ანალიზი კითხვის მიხედვით შეარჩიეთ. რამდენი უჯრედია ამჟამად ცოცხალი — ეს დათვლის საკითხია, რომელსაც მიკროსკოპითა და სამუშაო ფურცლით პასუხობთ. რამდენად აქტიურად სუნთქავს ეს კულტურა — ეს კინეტიკური საკითხია, რომელსაც წამზომითა და კონტროლირებულ სინჯარებში პასუხობთ. მეთილენის ლურჯი ორივეს ემსახურება, მაგრამ არასდროს ერთსა და იმავე სინჯარაში ერთდროულად.