მეთილენის ლურჯი და ანთებითი სიგნალიზაცია: ინფლამასომები, IL-6 და STAT3

დავუშვათ, სამი ლაბორატორია იუწყება, რომ ერთსა და იმავე ლურჯ ნაერთს ანთების საწინააღმდეგო მოქმედება აქვს. ერთი მაკროფაგებიდან IL-1beta-ს ნაკლებ გამოყოფას აჩვენებს. მეორე იმავე ტიპის უჯრედებში iNOS ფერმენტის ნაკლებ რაოდენობას აჩვენებს. მესამე სისხლში IL-6-ის ნაკლებ რაოდენობასა და ტვინში STAT3-ის ნაკლებ აქტივობას აჩვენებს. ჩნდება ცდუნება, სამივე ერთ მტკიცებად გავაერთიანოთ. ასეთი გაერთიანება აღმოჩენის არსს ფარავს.

თითოეული შედეგი სიგნალიზაციის განსხვავებულ მექანიზმს მიეკუთვნება, რომელსაც თავისი გამომწვევი ფაქტორი, აწყობის ეტაპი და გაზომვადი მაჩვენებელი აქვს. მეთილენის ლურჯი თითოეულ მექანიზმზე სხვადასხვა წერტილში მოქმედებს. აუმჯობესებს თუ არა რომელიმე მათგანი ჯანმრთელობის შედეგებს, ცალკე საკითხია, რომელსაც განვიხილავთ ჩვენს მეთილენის ლურჯისა და ანთების მიმოხილვაში. ეს გვერდი მხოლოდ სასიგნალო გზებს ეხება.

გზა 1: ინფლამასომის აწყობა და კასპაზა-1

ინფლამასომა ცილოვანი კარკასია, რომელიც საჭიროებისას მიელოიდურ უჯრედში იქმნება. მისი ნაწილებია სენსორი, ადაპტორი სახელად ASC და ეფექტორული ფერმენტი სახელად კასპაზა-1. აწყობის შემდეგ კასპაზა-1 pro-IL-1beta-სა და pro-IL-18-ს მათ სეკრეტირებად ფორმებად გარდაქმნის პროტეოლიზური დაჭრით და შეუძლია პიროპტოზის — უჯრედის სიკვდილის ანთებითი ფორმის — გამოწვევა. ტიპს სენსორი განსაზღვრავს: NLRP3 რეაგირებს კრისტალებსა და ფორების წარმომქმნელ ტოქსინებზე, როგორიცაა ნიგერიცინი და ATP; NLRC4 რეაგირებს ბაქტერიულ ფლაგელინზე; AIM2 რეაგირებს ციტოზოლურ ორჯაჭვიან DNA-ზე; არაკანონიკური გზა კი უჯრედშიდა ლიპოპოლისაქარიდზე რეაგირებს.

აქტივაციისთვის ორი სიგნალია საჭირო. პირველი სიგნალი წინასწარი მომზადებაა: Toll-ის მსგავსი რეცეპტორის ლიგანდი ააქტიურებს NLRP3-ისა და pro-IL-1beta-ს NF-kB-ზე დამოკიდებულ ტრანსკრიფციას, რათა შესაბამისი კომპონენტები წარმოიქმნას. მეორე სიგნალი აწყობაა: მეორე გამომწვევი ფაქტორი იწვევს ASC-ის ოლიგომერიზაციას წერტილოვან აგრეგატებად, კასპაზა-1-ის დაჭრას p20 ფრაგმენტის წარმოქმნით და მომწიფებული IL-1beta p17-ის გამოყოფას. ცნობილია, რომ მიტოქონდრიული ჟანგბადის რეაქტიული ფორმები და კრისტალების შთანთქმა NLRP3-ის მეორე სიგნალში მონაწილეობს.

ინფლამასომების ფართო სპექტრის ინჰიბირების შესახებ მაკროფაგებში ჩატარებულმა 2017 წლის კვლევამ მეთილენის ლურჯი ორივე სიგნალის ეტაპზე გამოსცადა. ლიპოპოლისაქარიდით წინასწარ მომზადებულ თაგვის ძვლის ტვინის მაკროფაგებში ნიგერიცინი, ATP და მონონატრიუმის ურატის კრისტალები თითოეული იწვევდა IL-1beta-სა და კასპაზა-1-ის გამოყოფას, აგრეთვე ASC-ის წერტილოვანი აგრეგატების წარმოქმნას. მეთილენის ლურჯი 20-დან 200 მიკრომოლარამდე კონცენტრაციით სამივე მაჩვენებელს დოზაზე დამოკიდებულად ამცირებდა, უჯრედების განადგურების გარეშე. იგივე სურათი გამოვლინდა NLRC4-ისთვის ფლაგელინისა და Salmonella-ს, AIM2-ისთვის ორჯაჭვიანი DNA-სა და Listeria-ს, ხოლო არაკანონიკური გზისთვის ტრანსფექციით შეტანილი ლიპოპოლისაქარიდის ან ცოცხალი E. coli-ს გამოყენებისას. ნაერთი დამოუკიდებლად გამოყოფას არ იწვევდა, ხოლო საკონტროლო ფირფიტებზე ანტიბაქტერიული ეფექტი არ გამოვლენილა, ამიტომ შედეგი მასპინძელი ორგანიზმის პასუხს უკავშირდება.

სასიგნალო გზის უფრო ადრეულ ეტაპებზე ზემოქმედების სამი სახე გაზომეს. მეთილენის ლურჯის ზემოქმედებით შემცირდა როტენონით გამოწვეული მიტოქონდრიული სუპეროქსიდი და მასთან ერთად — როტენონით გამოწვეული IL-1beta-ს გამოყოფაც. შემცირდა ფლუორესცენტული მიკროსფეროების შთანთქმა, რაც კრისტალების ამოცნობამდე ფაგოციტოზის შემცირებას შეესაბამება. რეპორტერი, რომელსაც NF-kB-ის ორი უბნის შემცველი NLRP3-ის პრომოტორი მართავდა, მეთილენის ლურჯის ზემოქმედებით ნაკლებ აქტივობას აჩვენებდა, ხოლო ამ უბნების გარეშე არსებული დამოკლებული პრომოტორი არ რეაგირებდა. უჯრედების გარეშე სინჯარაში მეთილენის ლურჯმა ასევე პირდაპირ შეამცირა ადამიანის რეკომბინანტული კასპაზა-1-ის აქტივობა. ნაერთის დამატება მხოლოდ წინასწარი მომზადების ან მხოლოდ აქტივაციის ეტაპზე მაინც ამცირებდა IL-1beta-ს, IL-18-ისა და კასპაზა-1-ის გამოყოფას, რაც ორივე ეტაპის ჩართულობაზე მიუთითებს.

თაგვებზე ჩატარებული ცდებიც ამ შერჩევითობას შეესაბამებოდა. ლიპოპოლისაქარიდის ლეტალური დოზა საკონტროლო ცხოველებს რამდენიმე საათში კლავდა, მეთილენის ლურჯი კი გადარჩენის მაჩვენებელს აუმჯობესებდა; პერიტონეულ სითხეში IL-1beta შემცირდა, მაგრამ იმავე სითხეში IL-6 — არა. Listeria-თი გამოწვეული პერიტონიტის მოდელში პერიტონეულ სითხეში IL-1beta შემცირდა, ხოლო უჯრედების საერთო რაოდენობა უცვლელი დარჩა. ადამიანის THP-1 მონოციტები ინფლამასომის ოთხივე ტიპის შემთხვევაში თაგვის მაკროფაგების მსგავსად იქცეოდა. ინფლამასომის შესახებ შედეგი IL-1beta-სა და IL-18-ის მომწიფებას ხსნის და არა ყველა ციტოკინის ცვლილებას. სწორედ ამიტომ ტვინის იმუნური უჯრედების ფორმა მიკროგლიისა და ასტროციტების ექსპერიმენტებში განსხვავებულ კითხვას პასუხობს, ვიდრე კარკასის აწყობა.

გზა 2: iNOS-ის ტრანსკრიფცია NF-kB-ისა და STAT1-ის შეკავშირების მეშვეობით

ინდუცირებადი აზოტის ოქსიდის სინთაზა, ანუ iNOS, მოსვენებულ მდგომარეობაში თითქმის არ არის წარმოდგენილი და მისი ტრანსკრიფცია საჭიროებისას ხდება. ლიპოპოლისაქარიდი მას ძირითადად IkB-alpha-ს დაშლის გზით ააქტიურებს, რასაც NF-kB-ის ფოსფორილირება და ბირთვში შესვლა მოსდევს. ინტერფერონ-გამა მას ძირითადად იანუს-კინაზის მიერ STAT1-ის ფოსფორილირების გზით ააქტიურებს, რასაც STAT1-ის ბირთვში შესვლა მოსდევს. შემდეგ თითოეული ფაქტორი iNOS-ის პრომოტორზე თავის შესაბამის უბანს უკავშირდება. ფერმენტის აქტივობა და გენის ინდუქცია კონტროლის დამოუკიდებელი წერტილებია და პრეპარატს შეუძლია ერთ-ერთზე ან ორივეზე იმოქმედოს.

მაკროფაგებსა და ენდოტოქსემიურ თაგვებში iNOS-ის ინდუქციის შესახებ 2015 წლის კვლევამ ეფექტი საინფორმაციო რნმ-ის დონეზე გამოავლინა. RAW 264.7 უჯრედებსა და თაგვის პირველად მაკროფაგებში ლიპოპოლისაქარიდის, ინტერფერონ-გამას ან ორივეს დამატებამდე 30 წუთით ადრე შეყვანილი 1 მიკრომოლარული მეთილენის ლურჯი 8-დან 24 საათამდე პერიოდში ამცირებდა iNOS-ის ცილასა და mRNA-ს; ამასთან, გარემოში ნიტრიტი მცირდებოდა, უჯრედების სიცოცხლისუნარიანობა კი არ იკლებდა. თაგვებში, რომლებსაც თითო kg-ზე 25 mg ლიპოპოლისაქარიდი მიეცათ, ერთი საათით ადრე შეყვანილმა მეთილენის ლურჯის ერთჯერადმა დოზამ, თითო kg-ზე 5 mg-ის ოდენობით, ფილტვში, ღვიძლსა და გულში iNOS-ის ცილა და mRNA შეამცირა.

გამორჩეული დეტალია ის, რაც არ შეცვლილა. IkB-alpha-ს დაშლა, NF-kB-ის ფოსფორილირება, STAT1-ის ფოსფორილირება და ორივე ფაქტორის ბირთვში დაგროვება უცვლელი დარჩა. შეფერხება ერთი ეტაპით გვიან გამოვლინდა: ბირთვულ ექსტრაქტებში ლიპოპოლისაქარიდის შემდეგ NF-kB ნაკლებად უკავშირდებოდა DNA-ს თავის შესაბამის ელემენტს, ხოლო ინტერფერონ-გამას შემდეგ STAT1-ის შეკავშირება მცირდებოდა. ქრომატინის იმუნოპრეციპიტაციამ დაადასტურა, რომ უჯრედებში iNOS-ის პრომოტორზე ორივე ფაქტორი ნაკლებად იყო შეკავშირებული. შემცირდა სიმსივნის ნეკროზის ფაქტორი ალფაც, რომლის პრომოტორიც ასევე იყენებს NF-kB-ს. ფაქტორები აქტიურდებოდა და დანიშნულების ადგილზე აღწევდა, მაგრამ სამიზნე DNA-ს სუსტად უკავშირდებოდა.

ყურადღება მიაქციეთ განსხვავებას პირველ გზასთან. აქ საუბარია ფაქტორის DNA-სთან შეკავშირებაზე, მონაწილეობს STAT1 და არა STAT3, ხოლო გაზომილი მაჩვენებლებია mRNA, ცილა და ნიტრიტი და არა ASC-ის წერტილოვანი აგრეგატები და კასპაზა-1-ის ფრაგმენტები. ჩვენი მეთილენის ლურჯის სამიზნეების რუკა სხვადასხვა უჯრედულ მოდელში ტრანსკრიფციის ამ დონეს პირდაპირი ფერმენტული და მიტოქონდრიული გაზომვებისგან ცალკე განიხილავს.

გზა 3: შრატის IL-6 და ქსოვილებში STAT3-ის აქტივაცია

IL-6 სიგნალს gp130 რეცეპტორების ოჯახის მეშვეობით გადასცემს იანუს-კინაზიდან STAT3-მდე კასკადს. ფოსფორილირებული STAT3 დიმერიზდება, ბირთვში შედის და ანთებით პროგრამებს ააქტიურებს. თავად IL-6 კი NF-kB-ის სამიზნეა, ამიტომ ეს ორი უკუკავშირის მარყუჟს ქმნის, რომელსაც ხშირად IL-6-დან STAT3-მდე ღერძს უწოდებენ. სტანდარტული გაზომვადი მაჩვენებლებია შრატის IL-6 გზის ზედა ნაწილში, ფოსფორილირებული STAT3-ის შეფარდება საერთო STAT3-თან და ეფექტორული ფერმენტები, როგორიცაა iNOS და COX2, გზის ქვედა ნაწილში.

ლიპოპოლისაქარიდის შემდეგ IL-6-ისა და STAT3-ის შესახებ თაგვებზე ჩატარებულმა 2023 წლის კვლევამ ეს ღერძი ორგანიზმის სხვადასხვა ნაწილში გაზომა. მამრ C57BL/6 თაგვებს სამი დღის განმავლობაში ყოველდღიურად აძლევდნენ თითო kg-ზე 1 mg ლიპოპოლისაქარიდს, ყოველი დოზიდან 30 წუთის შემდეგ კი — თითო kg-ზე 5 ან 10 mg მეთილენის ლურჯს. მესამე დღეს მეთილენის ლურჯის ორივე ჯგუფში შრატის IL-6 უფრო დაბალი იყო, ვიდრე მხოლოდ ლიპოპოლისაქარიდის ჯგუფში, მაშინ როცა გამოკვლეული სხვა ციტოკინების უმეტესობა ჩარევის შედეგად არ შეცვლილა. ფოსფორილირებული STAT3-ის შეფარდება საერთო STAT3-თან უფრო დაბალი იყო ქერქში, ჰიპოკამპსა და ყურის კანში; ამასთან, შემცირდა მიკროგლიის Iba-1-ით შეღებვა, iNOS და COX2, ხოლო წონის კლება ნაწილობრივ შესუსტდა.

აქ ორი სიფრთხილის საკითხია გასათვალისწინებელი. შრატის IL-6-ის შემცირება ქსოვილებში STAT3-ის ფოსფორილირების შემცირებასთან ერთად ღერძის მოდულაციას შეესაბამება, მაგრამ ზემოქმედების პირველად კვანძს არ გამოყოფს: გზის ადრეულ ეტაპზე ციტოკინის შემცირებამ, რეცეპტორული სიგნალიზაციის შემცირებამ ან ფოსფატაზის აქტივობის ცვლილებამ შეიძლება ერთნაირი შეფარდება გამოიწვიოს. ამასთან, მწვავე ზემოქმედების სამი დღის განმავლობაში წონის ცვლილება მთელი ცხოველის დონეზე გაზომილი მაჩვენებელია და არა სიმპტომების ან რემისიის ქულა. ის იმუნობლოტის მონაცემებს დამატებით კონტექსტს სძენს, მაგრამ სასიგნალო შედეგს მკურნალობის შესახებ მტკიცებად არ აქცევს. მიტოქონდრიებში ჟანგვა-აღდგენითი პროცესების ცალკეული ქიმია ციტოკინების ამ სურათის პარალელურად მიმდინარეობს და მასთან არ უნდა გაერთიანდეს.

გზების შედარება: ზემოქმედების წერტილები და გაზომილი მაჩვენებლები

ცხრილი სამ არასწორ განზოგადებას გამორიცხავს. ASC-ის წერტილოვანი აგრეგატის შესახებ შედეგი STAT3-ის შესახებ შედეგს არ ამტკიცებს. STAT1-ის iNOS-ის პრომოტორთან შეკავშირების შესახებ შედეგი STAT3-ის შესახებ შედეგს არ ამტკიცებს, მიუხედავად იმისა, რომ ორივე ცილა STAT-ის ოჯახის წევრია. შრატის IL-6-ის შესახებ შედეგი ინფლამასომის აწყობის შემცირებას არ ამტკიცებს: პერიტონეულ ექსპერიმენტში IL-1beta შემცირდა, IL-6 კი — არა. თითოეულ მწკრივს თავისი გამომწვევი ფაქტორი და გაზომვადი მაჩვენებელი სჭირდება. ამიტომ მეთილენის ლურჯის უჯრედული, ცხოველური და კლინიკური კვლევების წაკითხვისას აუცილებელია თითოეული მტკიცების დაკავშირება იმ დონესთან, რომელზეც ის გაზომეს.

არცერთი ეს შედეგი არ ადგენს ადამიანებში დოზირებას, უსაფრთხოებას ან სარგებელს. ლიპოპოლისაქარიდის მოდელები მექანიზმის შესამოწმებლად გამოყენებული კონტროლირებადი გამომწვევი ფაქტორებია და არა ქრონიკული დაავადების ასლები. გამომწვევ ფაქტორთან ერთად ნივთიერების შეყვანა კი გამოწვეული ცვლილების თავიდან აცილებას ამოწმებს და არა უკვე ჩამოყალიბებული დაავადების უკუქცევას. მექანიზმების ეს აღწერა პაციენტებში მიღებული შედეგებისგან ცალკე განიხილეთ და ჯანმრთელობის შესახებ ნებისმიერი მტკიცება მის საფუძვლად არსებული პაციენტების კვლევის მიხედვით შეაფასეთ.