მეთილენის ლურჯი G6PD-ის ლაბორატორიულ ტესტებში: რას აკეთებს სინამდვილეში საღებავი

სტუდენტი ინკუბაციის შემდეგ ორ სინჯარას აკვირდება. ერთმა მოსალოდნელი ფერი მიიღო, მეორემ — არა. სტუდენტი ასკვნის, რომ მეორე პაციენტს გლუკოზა-6-ფოსფატდეჰიდროგენაზის დეფიციტი აქვს. ეს დასკვნა შეიძლება სწორი იყოს, მაგრამ მსჯელობაში გამოტოვებულია ის პრინციპი, რომელსაც ტესტის მუშაობა ეფუძნება. სინჯარაში არაფერი ზომავს ფერმენტს უშუალოდ. სინჯარაში იზომება ის, რასაც ფერმენტი წარმოქმნის, ხოლო მეთილენის ლურჯი შუამავლის როლს ასრულებს.

როცა ეს არაპირდაპირი მექანიზმი გასაგებია, პროცედურა, კონტროლები და მცდარი შედეგების გრძელი სია თვითნებურად შერჩეული აღარ ჩანს.

მოკლე პასუხი

G6PD-ის ტესტირებაში მეთილენის ლურჯი ჟანგვა-აღდგენის ინდიკატორია. ფერმენტი G6PD წარმოქმნის NADPH-ს, ხოლო NADPH-ზე დამოკიდებული სისტემები ლურჯ მეთილენის ლურჯს მის უფერო ლეიკოფორმამდე აღადგენს ან ელექტრონების გადასატანად იყენებს. ფერმენტის ნორმალური აქტივობა ეფექტიან აღდგენას უზრუნველყოფს. აქტივობის დეფიციტისას აღდგენა ნელი ან არასრულია. ტესტის მთელი სიგნალი სწორედ ესაა.

ორი ისტორიული მეთოდი ერთსა და იმავე საღებავს იყენებს, მაგრამ საბოლოო მაჩვენებლით განსხვავდება. თუ მათ ერთმანეთისგან განასხვავებთ, გაუგებრობის დიდი ნაწილი გაქრება.

ორი ტესტი, ერთი საღებავი, განსხვავებული საბოლოო მაჩვენებლები

პირველია მეთილენის ლურჯის პირდაპირი აღდგენის ტესტი, რომელიც სასმა და მისმა კოლეგებმა აღწერეს, მოგვიანებით კი გიბსმა შეაფასა. აქ საბოლოო მაჩვენებელი თავად საღებავია: დაჟანგული ლურჯი მეთილენის ლურჯი უფერო ლეიკომეთილენის ლურჯამდე აღდგება, ხოლო ამ ცვლილების სიჩქარე NADPH-ის წარმოქმნის უნარს ასახავს. სკრინინგის პირველადი ნაშრომი ინდექსირებულია PubMed-ში სასისა და თანაავტორების სახელით (1966).

მეორეა ბრიუერის მეტჰემოგლობინის აღდგენის ტესტი. ნატრიუმის ნიტრიტი ჯერ ჰემოგლობინს ყავისფერ მეტჰემოგლობინამდე ჟანგავს. შემდეგ მეთილენის ლურჯი ელექტრონების გადაცემის შუამავლად მოქმედებს: აღდგენილი მეთილენის ლურჯი მეტჰემოგლობინს აღმდგენ ეკვივალენტებს გადასცემს და მას კვლავ წითელ ჰემოგლობინად გარდაქმნის. ამიტომ ხილული საბოლოო მაჩვენებელი ყავისფერისა და წითლის შედარებაა და არა ლურჯისა და უფეროსი. თავდაპირველი მეთოდი გამოქვეყნდა ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის ბიულეტენში (ბრიუერი და თანაავტორები, 1960).

ბრიუერის ანალიზის საღებავის გაუფერულების ტესტად მოხსენიება ქიმიური თვალსაზრისით არაზუსტია. საღებავი ციკლურად იცვლის ჟანგვა-აღდგენით მდგომარეობას; ფერს კი ჰემოგლობინი იცვლის. ქვემოთ მოცემული დიაგრამა ორივე გზას ასახავს.

რეაქცია, რომელსაც ტესტი ეფუძნება

G6PD პენტოზაფოსფატური გზის პირველი ჟანგვითი ეტაპის კატალიზატორია:

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

მომწიფებული ერითროციტები NADPH-ის მისაღებად მნიშვნელოვნად არიან დამოკიდებული ამ გზაზე, როგორც განხილულია ლუცატოსა და მისი კოლეგების მიმოხილვაში, ჟურნალ Blood-ში (2020). NADPH გლუტათიონს აღდგენილ მდგომარეობაში ინარჩუნებს და უჯრედს ჟანგვითი დაზიანებისგან იცავს. მეთილენის ლურჯი ამ სისტემაში ელექტრონების მიმღების როლით ერთვება. G6PD-ის საკმარისი აქტივობა უზრუნველყოფს საკმარის NADPH-ს, რაც, თავის მხრივ, ეფექტიან აღდგენას უზრუნველყოფს. G6PD-ის დაბალი აქტივობა ამ ჯაჭვს პირველივე რგოლში წყვეტს.

საღებავი საწვავის მაჩვენებლად წარმოიდგინეთ და არა ძრავად. ის NADPH-ის მარაგს ასახავს. ნებისმიერ სხვა ფაქტორს, რომელიც ამ მარაგს ან გაზომვის შედეგს ცვლის, შეუძლია მაჩვენებელი გენში ყოველგვარი ცვლილების გარეშე შეცვალოს.

როგორ ტარდება ბრიუერის ტიპის პროცედურა

ათწლეულების განმავლობაში რეაგენტების შემადგენლობა იცვლებოდა, ამიტომ სასწავლო აღწერა კლინიკურ პროტოკოლად არ უნდა ჩაითვალოს. თითოეული ლაბორატორია საკუთარ ვალიდირებულ სტანდარტულ სამუშაო პროცედურას მიჰყვება. ამ გაფრთხილების გათვალისწინებით, კლასიკური სინჯარული მეთოდი შემდეგნაირად სრულდება; სამი სინჯარისა და 3-საათიანი ინკუბაციის გამოყენება აღწერილია ამ გამოქვეყნებულ განხორციელებაში:

1. პაციენტის სინჯარა: მთლიანი სისხლი გლუკოზის, ნატრიუმის ნიტრიტისა და მეთილენის ლურჯის დამატებით. ნიტრიტი წარმოქმნის მეტჰემოგლობინს, გლუკოზა ერითროციტების მეტაბოლიზმის სუბსტრატია, ხოლო საღებავი NADPH-ზე დამოკიდებულ ელექტრონების გადატანას უზრუნველყოფს.
2. დაჟანგული კონტროლი: სისხლი ნიტრიტისა და გლუკოზის დამატებით, მაგრამ მეთილენის ლურჯის გარეშე. ის აჩვენებს ყავისფერ მეტჰემოგლობინურ საბოლოო ფერს — დეფიციტისთვის დამახასიათებელ სურათს.
3. ჰემოგლობინის კონტროლი: სისხლი წყლის დამატებით. ის აჩვენებს წითელ ჰემოგლობინურ საბოლოო ფერს — ნორმისთვის დამახასიათებელ სურათს.
4. ჩაატარეთ ინკუბაცია ყველა სინჯარისთვის დაახლოებით 37 C-ზე, ჩვეულებრივ 3 საათის განმავლობაში, ნაზი შერევით.
5. განაზავეთ თითოეული სინჯარიდან აღებული მცირე ალიკვოტი გამოხდილ წყალში, რათა უჯრედები დაიშალოს და ფერების შედარება შესაძლებელი გახდეს.
6. შეადარეთ პაციენტის სინჯარა ორივე კონტროლს. წითელი ფერისკენ დაბრუნება მნიშვნელოვან აღმდგენ უნარზე მიუთითებს. ყავისფერი ფერის შენარჩუნება გამოხატულ დეფიციტს მიანიშნებს.

ერთ ისტორიულ ფორმულირებაში გამოიყენებოდა დაახლოებით 1 mL სისხლი რეაგენტებთან ერთად, რომელთა კონცენტრაციები დაახლოებით 180 mM ნატრიუმის ნიტრიტი, 280 mM დექსტროზა და 0.4 mM მეთილენის ლურჯი იყო. ეს რიცხვები ლიტერატურიდან მოყვანილ მაგალითად მიიჩნიეთ და არა უნივერსალურ სპეციფიკაციად.

შედეგის შეფასება

ხარისხობრივი სკრინინგი საუკეთესოდ განასხვავებს აქტივობას ნორმის დაახლოებით 30-დან 40 პროცენტამდე დიაპაზონში, როგორც განხილულია ჟურნალ Malaria Journal-ის ამ მიმოხილვაში G6PD-ის გამოვლენის ხარვეზების შესახებ. ამიტომ სკრინინგის ნორმალური შედეგი ნიშნავს, რომ ანალიზმა მძიმე დეფიციტი ვერ გამოავლინა. ის სრულად ნორმალურ აქტივობას არ ადასტურებს.

რატომ შეიძლება სკრინინგმა შეცდომაში შეგვიყვანოს

ჰემოლიზის შემდგომი რეტიკულოციტოზი ცრუ ნორმალური შედეგის კლასიკური მიზეზია. ახალგაზრდა ერითროციტები და რეტიკულოციტები ძველ უჯრედებზე მეტ G6PD-ს შეიცავს. მწვავე ჰემოლიზური ეპიზოდის დროს ყველაზე ძველი და ყველაზე დეფიციტური უჯრედები შესაძლოა უკვე განადგურებული იყოს, რის შედეგადაც რჩება ახალგაზრდა უჯრედების პოპულაცია, რომლის აქტივობაც ტესტში ნორმალური ჩანს. იგივე ბიოლოგიური მექანიზმი შეცდომაში შეჰყავს რაოდენობრივ ანალიზებსაც და არა მხოლოდ საღებავზე დაფუძნებულ სკრინინგს.

ახლახან ჩატარებული ტრანსფუზია დეფიციტს ფარავს, რადგან დონორის ერითროციტებს ნიმუშში საკუთარი ფერმენტი შეაქვთ. Mayo Clinic Laboratories ტრანსფუზიას ასახელებს ფერმენტის არასანდო შედეგების მიზეზებს შორის, რეტიკულოციტოზსა და ლეიკოციტების ინტერფერენციასთან ერთად.

ჰეტეროზიგოტი ქალები ყველაზე რთული შემთხვევაა. X-ქრომოსომის შემთხვევითი ინაქტივაცია ნორმალური და დეფიციტური ერითროციტების ნარევს წარმოქმნის, ხოლო საერთო აქტივობა შეიძლება მძიმე დეფიციტიდან მოჩვენებით ნორმალურ მაჩვენებლამდე ნებისმიერ დონეზე იყოს. ხარისხობრივი სკრინინგი ხშირად ვერ ავლენს შუალედურ ფენოტიპებს. ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის დოკუმენტაცია G6PD-ის ტესტირების შესახებ ამ შეზღუდვას დეტალურად განიხილავს.

ნიმუშის ასაკი, შენახვის ტემპერატურა, საბოლოო ფერის ვიზუალური შეფასების სუბიექტურობა, ჰემატოკრიტი და რეაგენტების ხარისხი ამ ბიოლოგიურ ეფექტებს დამატებით ანალიზურ ცდომილებას უმატებს.

სკრინინგი დიაგნოზი არ არის

დეფიციტური, შუალედური ან კლინიკურ სურათთან შეუსაბამო სკრინინგის შედეგი მოითხოვს G6PD ფერმენტის რაოდენობრივ ანალიზს. ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაცია რეფერენტულ მიდგომად ტემპერატურის კონტროლით ჩატარებულ რაოდენობრივ სპექტროფოტომეტრიას მიიჩნევს. ამ ანალიზში ერითროციტების ჰემოლიზატს ემატება გლუკოზა-6-ფოსფატი და NADP+, ხოლო წარმოქმნილი NADPH-ის მონიტორინგი ხდება 340 nm-ზე შთანთქმის ზრდის მიხედვით. ცვლილების სიჩქარე ფერმენტის აქტივობის პროპორციულია და ჩვეულებრივ ჰემოგლობინის რაოდენობაზე ნორმირდება, ერთეულებით გრამზე. მიმდინარე კლინიკურ-ლაბორატორიული პრაქტიკა შეჯამებულია Mayo-ს ტესტების კატალოგის ჩანაწერში G6PD-ის აქტივობის შესახებ.

ინტერპრეტაციისთვის გამოიყენება ლაბორატორიის მიერ ვალიდირებული რეფერენტული დიაპაზონი, რომელიც ხშირად პოპულაციის ნორმალურ აქტივობასთან მიმართებით განისაზღვრება; დეფიციტის ზღურბლად ჩვეულებრივ დაახლოებით 30 პროცენტი განიხილება, ხოლო შუალედური აქტივობა მის ზემოთაა. ჯანდაცვის მსოფლიო ორგანიზაციის სამიზნე პროდუქტის პროფილები G6PD-ის ტესტებისთვის (2022) ამ დიაგნოსტიკურ ჩარჩოს აღწერს. თუ ახლახან გადატანილი ჰემოლიზი ან ტრანსფუზია ფენოტიპის განსაზღვრას არასანდოს ხდის, ტესტირება გაიმეორეთ ერითროციტების პოპულაციის ხელახალი დაბალანსების შემდეგ; მოლეკულურ ტესტირებას შეუძლია დამატებითი ინფორმაციის მოწოდება, თუმცა ის ფერმენტის გაზომვას ვერ ჩაანაცვლებს.

განსხვავება, რომელიც უნდა შევინარჩუნოთ

ამ ანალიზებში მეთილენის ლურჯი ex vivo ლაბორატორიული რეაგენტია. ეს საკითხი ცალკე უნდა განიხილებოდეს პაციენტისთვის მეთილენის ლურჯის შეყვანის უსაფრთხოებისგან, რომელიც აღწერილია მეთილენის ლურჯის უკუჩვენებების სახელმძღვანელოში. მათ ბიოქიმია აკავშირებს, რადგან პრეპარატიც NADPH-ზე დამოკიდებულ აღდგენას საჭიროებს, მაგრამ სინჯარაში არსებული საღებავი სისხლის მიმოქცევაში შეყვანილი დოზა არ არის. იმის გასაგებად, თუ როგორ მოქმედებს საღებავი შემღებავად სხვა გარემოში, იხილეთ მეთილენის ლურჯით შეღებვის პრინციპები, ხოლო მისი ქიმიური ოჯახის შესახებ — ჟანგვა-აღდგენის საღებავები ლაბორატორიაში.

სკრინინგი სვამს კითხვას: გამოიყურება თუ არა აღმდგენი უნარი შენარჩუნებულად? დამადასტურებელი ტესტირება კი არკვევს, რეალურად რამდენია ფერმენტი. პირველ კითხვას საღებავი კარგად პასუხობს, თუ მისგან მეორეზე პასუხს არავინ მოითხოვს.