მეთილენის ლურჯი ბიოფილმების წინააღმდეგ: რას ზომავს სინათლით გააქტიურების ლაბორატორიული კვლევები

ბიოფილმი სითხეში მოტივტივე უჯრედების ერთობლიობა არ არის. ის სტრუქტურაა: ზედაპირზე მიმაგრებული უჯრედები მოქცეულია მათ მიერ წარმოქმნილ პოლისაქარიდების, ცილებისა და უჯრედგარე დნმ-ის მატრიქსში, სადაც გარედან შიგნით ჟანგბადისა და საკვები ნივთიერებების კონცენტრაციის გრადიენტები არსებობს. სწორედ ამ სტრუქტურის გამო შეიძლება ნაერთმა, რომელიც სუსპენზიაში მყოფ ბაქტერიებს წუთებში კლავს, ვერ იმოქმედოს იმავე ორგანიზმებზე, როცა ისინი ბიოფილმის სახით იზრდება. მეთილენის ლურჯისა და ბიოფილმების შესახებ ნებისმიერი მტკიცება ამ სტრუქტურის გათვალისწინებით უნდა წავიკითხოთ, რადგან მატრიქსი განსაზღვრავს, რამდენი საღებავი მიაღწევს უჯრედებამდე და რამდენი სინათლე — საღებავამდე.

ეს მიმოხილვა ზუსტად სამ წყაროს მოიცავს. ერთი მათგანი ზოგად კონტექსტს ეხება. ორი ლაბორატორიული ექსპერიმენტია. მეთოდის არსი სწორედ ამ როლების გამიჯვნაა, რაც ამ თემაში ყველაზე გავრცელებულ შეცდომას გვარიდებს: ლაბორატორიულ ჭურჭელში მიღებული შედეგის ციტირებას ისე, თითქოს ის ადამიანში ინფექციის მკურნალობის მტკიცებულება იყოს.

ზოგადი კონტექსტის წყარო ქიმიას ეხება და არა მიკროორგანიზმების განადგურებას

სამიდან ყველაზე ძველია 2005 წელს გამოქვეყნებული ფენოთიაზინიუმის ფოტოსენსიბილიზატორების შემუშავების ნარატიული მიმოხილვა. ის აღწერს მეთილენის ლურჯის გზას მე-19 საუკუნის საღებავიდან კიბოს ფოტოდინამიკური თერაპიისთვის, მოგვიანებით კი ფოტოდინამიკური ანტიმიკრობული ქიმიოთერაპიისთვის პერსპექტიულ საწყის ნაერთამდე. მისი წვლილი სტრუქტურასა და აქტივობას შორის კავშირის აღწერაა: ქრომოფორის მეთილირება ზრდის ლიპოფილურობას, სინგლეტური ჟანგბადის გამოსავლიანობასა და ფოტობაქტერიციდულ აქტივობას და ამავდროულად ანელებს ნაკლებად აქტიურ ლეიკოფორმამდე აღდგენას. მიმოხილვა სფეროს პრობლემასაც მკაფიოდ ასახელებს. ნაშრომების უმეტესობაში სტანდარტული კომერციული საღებავები გამოიყენებოდა, ხოლო წარმოებულების შემუშავებას შედარებით მცირე ყურადღება ეთმობოდა.

ეს მიმოხილვა თქვენი კონცეპტუალური მოდელის მექანიზმის ნაწილისთვის გამოიყენეთ: სინათლე საღებავს აღაგზნებს, ტრიპლეტური მდგომარეობა ჟანგბადთან ურთიერთქმედებს II ტიპის ენერგიის გადაცემით და წარმოქმნის სინგლეტურ ჟანგბადს, ან I ტიპის ელექტრონის გადაცემით წარმოქმნის რადიკალებს. სწორედ ამ მრავალფაქტორული შეტევის გამოა, რომ ჩვეულებრივი რეზისტენტობის მექანიზმები ფოტოდინამიკური განადგურების წინააღმდეგ ნაკლებად მოქმედებს. ნუ მიუთითებთ მას ლოგარითმული შემცირების დასადასტურებლად. ასეთი შემცირება მას არ გაუზომავს. ამ მექანიზმის საფუძვლად არსებული ფართო ფოტოქიმია განხილულია ფოტოდინამიკური თერაპიის მტკიცებულებათა კრებულში, ხოლო ტალღის სიგრძის წესები, რომლებიც განსაზღვრავს, შეუძლია თუ არა კონკრეტულ ნათურას ამ პროცესის გამოწვევა, აღწერილია სტატიაში როგორ შთანთქავს მეთილენის ლურჯი წითელ სინათლეს.

ბიოფილმის ორი ექსპერიმენტი, შედეგის ორი განსხვავებული გაგება

ორივე ექსპერიმენტული ნაშრომი პირის ღრუს ბიოფილმებზე მეთილენის ლურჯის ფოტოდინამიკურ მოქმედებას 660 nm-ზე ამოწმებს, სხვა მხრივ კი თითქმის არაფერში ემთხვევა ერთმანეთს. განსხვავებულია მიკრობული თანასაზოგადოებები, ასაკი, საღებავის ფორმულაციები, სინათლის დოზები და, უპირველესად, შედეგობრივი მაჩვენებლები. სწორედ ეს განსხვავებაა ამ სტატიის მთავარი საკითხი და ქვემოთ მოცემული ორიგინალური შედარებითი მასალის საფუძველი.

პირველია 2024 წელს გამოქვეყნებული მომწიფებული, მრავალსახეობრივი ღრძილქვეშა ბიოფილმის in vitro კვლევა. ოცდაცამეტ სახეობას ერთად ზრდიდნენ პოლისტიროლის ღეროებზე Calgary Biofilm Device მოწყობილობაში, ანაერობულ პირობებში საკვები ნივთიერებების მიწოდებით. საკვები არე 72 საათის შემდეგ იცვლებოდა და ზრდა გრძელდებოდა ნომინალურად 7 დღემდე. დამუშავებისთვის გამოიყენებოდა თავისუფალი მეთილენის ლურჯი 0.01 პროცენტიანი კონცენტრაციით და 660 nm წითელი LED, დაახლოებით 330 mW სიმძლავრით თითო კვადრატულ cm-ზე, 5 წუთის განმავლობაში, 2 mm მანძილიდან. ეს გამრავლებით დაახლოებით 99 J-ს იძლევა თითო კვადრატულ cm-ზე. კვლევის დიზაინი მკაფიო ფაქტორული სქემაა ოთხი ჯგუფით: დაუმუშავებელი კონტროლი, საღებავი სინათლის გარეშე, სინათლე საღებავის გარეშე და საღებავი სინათლესთან ერთად.

მეორეა 2021 წელს გამოქვეყნებული პირის ღრუს ადრეული კოლონიზატორების ბიოფილმის in vitro კვლევა. Streptococcus-ის ოთხ სახეობას ერთად ზრდიდნენ 24 საათის განმავლობაში, 96-ფოსოიან ფირფიტებში, 1 პროცენტი საქაროზით. ფოტოსენსიბილიზატორი იყო ბეტა-ციკლოდექსტრინის ნანონაწილაკებთან დაკავშირებული მეთილენის ლურჯი, 4.65 მიკრომოლარული კონცენტრაციით — მიწოდების ფორმულაცია, რომლის მიზანი საღებავის ბიოფილმის ბარიერებში გატარება იყო. ორივე სინათლის წყარო წითელი იყო, 660 nm ტალღის სიგრძითა და 90-წამიანი ექსპოზიციით, თუმცა დოზები მკვეთრად განსხვავდებოდა: ლაზერის ჯგუფში 320 J თითო კვადრატულ cm-ზე, ხოლო LED ჯგუფში — 8.1 J თითო კვადრატულ cm-ზე. საკონტროლო ჯგუფები მოიცავდა საღებავს სინათლის გარეშე, მხოლოდ ლაზერს, მხოლოდ LED-ს, ფიზიოლოგიურ ხსნარს უარყოფით კონტროლად და 0.2 პროცენტიან ქლორჰექსიდინს ანტიმიკრობული შედარების ეტალონად.

7 დღის, 33 სახეობისგან შემდგარი ანაერობული თანასაზოგადოება და 24 საათის, 4 სახეობისგან შემდგარი ადრეული კოლონიზატორების ბიოფილმი განსხვავებული საზომი სისტემებია. ქვემოთ მოყვანილი რიცხვების გასაშუალოება შეუძლებელია.

რას ზომავდა სინამდვილეში თითოეული კვლევა

მომწიფებული ბიოფილმის კვლევაში შედეგობრივი მაჩვენებლები იყო მეტაბოლური აქტივობა, შეფასებული TTC-ის აღდგენით და 485 nm-ზე წაკითხვით, და ბაქტერიების რაოდენობა, შეფასებული შახმატური სქემის დნმ–დნმ ჰიბრიდიზაციით 33 სახეობის ზონდების გამოყენებით; აღმოჩენის ზღვარი დაახლოებით 10,000 უჯრედი იყო. არ ჩატარებულა სიცოცხლისუნარიანი მიკროორგანიზმების დათვლა დათესვით, ბიომასის შეფასება კრისტალური იისფერით, ცოცხალი და მკვდარი უჯრედების ვიზუალიზაცია ან შემდგომი დაკვირვება ხელახალ ზრდაზე. მხოლოდ LED-მ მეტაბოლური აქტივობა დაახლოებით 50 პროცენტით შეამცირა იმ ჯგუფებთან შედარებით, რომლებშიც LED არ გამოიყენებოდა, ხოლო საღებავმა LED-სთან ერთად — დაახლოებით 55 პროცენტით. მხოლოდ საღებავის ჯგუფი სტატისტიკურად დაუმუშავებელ საკონტროლო ჯგუფთან ერთიანდებოდა. დნმ-ზე დაფუძნებული რაოდენობრივი მონაცემებით, მხოლოდ საღებავი, მხოლოდ LED და საღებავი LED-სთან ერთად საკონტროლო ჯგუფზე მნიშვნელოვნად დაბალ მაჩვენებლებს იძლეოდა, თუმცა ამ სამ ჯგუფს შორის მნიშვნელოვანი განსხვავება არ იყო. ავტორები დასკვნას პირდაპირ ასახელებენ: დამუშავებამ ჩამოყალიბებული, მიმაგრებული პოლიმიკრობული ბიოფილმი არ გაანადგურა, ხოლო მომწიფებულ პაროდონტულ ბიოფილმს მექანიკური დაშლა სჭირდება, ფოტოდინამიკა კი მაქსიმუმ დამხმარე საშუალებად შეიძლება განიხილებოდეს.

ადრეული კოლონიზატორების კვლევაში შედეგობრივი მაჩვენებელი იყო სელექციურ საკვებ არეებზე გამოყოფილი სიცოცხლისუნარიანი მიკროორგანიზმების რაოდენობა, გამოსახული ლოგარითმულ სკალაზე. სინათლის გარეშე საღებავის ჯგუფი ფიზიოლოგიური ხსნარის ჯგუფისგან არ განსხვავდებოდა. ორივე ფოტოაქტივირებულმა ჯგუფმა — ლაზერმა ინკაფსულირებულ საღებავთან ერთად და LED-მ ინკაფსულირებულ საღებავთან ერთად — სიცოცხლისუნარიანი მიკროორგანიზმების რაოდენობა უარყოფით კონტროლთან შედარებით დაახლოებით 4 log-მდე შეამცირა. ამ მაჩვენებლით ეს 10,000-ჯერ, ანუ 99.99 პროცენტით შემცირებაა, და არცერთი ჯგუფი სტატისტიკურად არ განსხვავდებოდა ქლორჰექსიდინისგან. მხოლოდ სინათლისა და სინათლის გარეშე დამუშავების შედეგები ცალკე სანდო ლოგარითმულ რიცხვებად არ იყო წარმოდგენილი, ამიტომ ზუსტი შეჯამება სწორედ ისაა, რასაც ნაშრომი ადასტურებს: შემცირება ფოტოაქტივირებულმა ინკაფსულირებულმა საღებავმა გამოიწვია, სინათლის გარეშე საღებავმა — არა, ხოლო ამ ახალგაზრდა ბიოფილმის მოდელში შემცირების სიდიდე ანტისეპტიკურ ეტალონს შეესაბამებოდა.

არცერთ ნაშრომში არ გაზომილა დამუშავების შემდეგ ხელახალი ზრდა, ნარჩენი ბიომასა ან მატრიქსის სტრუქტურა. CFU-ის შემცირება არაფერს ამბობს დარჩენილ მატრიქსზე. მეტაბოლიზმის დაქვეითება არაფერს ამბობს გადარჩენილ მიკროორგანიზმებზე. დნმ-ის რაოდენობით ვერ დგინდება, ვინ არის ცოცხალი.

შეფასების მეთოდებისა და შედეგობრივი მაჩვენებლების შედარება

ეს ცხრილი სტატიის შედარებითი მასალაა. წაიკითხეთ სტრიქონი ჰორიზონტალურად, რათა ნახოთ, რას ადასტურებს თითოეული კვლევა, ხოლო სვეტი — ვერტიკალურად, რათა დაინახოთ, რომელ კითხვებს ვერ პასუხობს ვერცერთი მათგანი.

ხაზგასმას სამი განსხვავება იმსახურებს. პირველი: მომწიფებულ მოდელში მხოლოდ სინათლის ჯგუფი თითქმის მთელ მეტაბოლურ ეფექტს ხსნის, ამიტომ 55 პროცენტიანი მაჩვენებელი საღებავით განპირობებულ განადგურებას არ ნიშნავს. მეორე: ახალგაზრდა მოდელში ფორმულაცია სინათლის გარეშე ინერტულია და ეფექტი მხოლოდ სინათლის ზემოქმედებისას ვლინდება, რაც ფოტოაქტივირების დამახასიათებელი ნიშანია. მესამე: დნმ-ზე დაფუძნებული რაოდენობის 80 პროცენტით კლება მათემატიკურად დაახლოებით 0.7 log-ს შეესაბამება მხოლოდ მაშინ, თუ ცვლადი სიცოცხლისუნარიანი მიკროორგანიზმების რაოდენობა იქნებოდა. აქ ასე არ არის, ამიტომ ეს მაჩვენებელი არასოდეს უნდა იყოს ციტირებული როგორც განადგურების ლოგარითმული მაჩვენებელი. კბილებთან დაკავშირებული ბიოფილმის დამატებითი კონტექსტი თავმოყრილია პირის ღრუს ბიოფილმისა და სტომატოლოგიური კვლევების მასალებში, ხოლო სხვადასხვა კვლევაში მოდელების, შეყვანის გზებისა და შედეგობრივი მაჩვენებლების გამიჯვნის ზოგადი მეთოდი დეტალურად არის აღწერილი ლაბორატორიული მეთოდების გზამკვლევში.

რატომ სჭირდება ბიოფილმის კვლევებს წაკითხვის საკუთარი წესები

ოთხი ცვლადი განსაზღვრავს, აქვს თუ არა მეთილენის ლურჯის ბიოფილმზე მიღებულ შედეგს მნიშვნელობა მისი კონკრეტული ლაბორატორიული ფირფიტის მიღმაც.

პირველია ბიოფილმის ასაკი და მატრიქსი. უფრო ძველი ბიოფილმები უფრო სქელია, მათში მეტი განივი კავშირია და საღებავი უფრო რთულად აღწევს შიგნით. 2021 წლის ნაშრომის ავტორები მთავარ შეზღუდვებად სწორედ შეღწევასა და ორგანიზებულ ბიოფილმში სინათლის ცუდ გავრცელებას ასახელებენ. გადამტანზე დაფუძნებული სტრატეგიები, მაგალითად, ციკლოდექსტრინში ინკაფსულირება, სწორედ ამ შეზღუდვის დაძლევის მცდელობაა. ამიტომ ფორმულაცია ექსპერიმენტული ცვლადია და არა უბრალო დეტალი.

მეორეა დოზის არითმეტიკა. აქ ენერგიის ზედაპირული სიმკვრივის მნიშვნელობები თითქმის ორმოცჯერ განსხვავდება: ერთსა და იმავე ტალღის სიგრძეზე 8.1-დან 320 J-მდე თითო კვადრატულ cm-ზე, ხოლო დასხივების სიმძლავრე — 90 mW-დან რამდენიმე W-მდე თითო კვადრატულ cm-ზე. ერთი და იგივე ტალღის სიგრძე ერთნაირ ექსპოზიციას არ ნიშნავს და არცერთი კვლევა არ ცვლის დოზას საკმარისად სისტემატურად, რომ დამოკიდებულების მრუდი განსაზღვროს.

მესამეა საკონტროლო ჯგუფები. კვლევა, რომელსაც სინათლის გარეშე საღებავის ჯგუფი არ აქვს, ვერ გამორიცხავს საღებავის საკუთარ ტოქსიკურობას, ხოლო კვლევა მხოლოდ სინათლის ჯგუფის გარეშე ვერაფერს მიაწერს ფოტოაქტივირებას. ორივე ნაშრომში ორივე ჯგუფია წარმოდგენილი, რაც მათი ღირსებაა. მომწიფებული ბიოფილმის ნაშრომი აჩვენებს, რატომ არის მნიშვნელოვანი მხოლოდ სინათლის ჯგუფი: მის გარეშე მეტაბოლური შედეგი საღებავის ეფექტად აღიქმებოდა.

მეოთხეა შედეგობრივი მაჩვენებლები. სიცოცხლისუნარიანობა, მეტაბოლიზმი, დნმ-ის რაოდენობა, ბიომასა, სტრუქტურა და ხელახალი ზრდა ექვსი განსხვავებული მტკიცების საფუძველია. აქ არცერთი ნაშრომი ორზე მეტს არ ზომავს. კერძოდ, ხელახალი ზრდა არსად არის შეფასებული, ამიტომ ეფექტის შენარჩუნება გაუზომავია და არა დადასტურებული.

რას ვერ ადასტურებს ეს ინფექციის მკურნალობის შესახებ

ამ ექსპერიმენტულ სისტემებში არ არის სისხლის მიმოქცევა, იმუნური უჯრედები, ნერწყვის ნაკადი, ღრძილის ღარის სითხის ცვლა ან მექანიკური დამუშავება. ფოსოში საღებავის კონცენტრაცია არ არის ადამიანში რომელიმე გზით შეყვანის შემდეგ ქსოვილში მიღებული კონცენტრაცია. ახალგაზრდა ან თუნდაც მომწიფებულ ლაბორატორიულ ბიოფილმზე ერთჯერადი 5-წუთიანი ან 90-წამიანი ზემოქმედება თერაპიის კურსი არ არის. მომწიფებული ბიოფილმის კვლევის ავტორები ამას თავადვე აღნიშნავენ: ფოტოდინამიკას მექანიკური მოცილების შესაძლო დამხმარე საშუალებად განიხილავენ და არა განადგურების დამოუკიდებელ მეთოდად.

სწორი შეჯამება ვიწროა და მყარად დასაბუთებული. ფოტოაქტივირებულ მეთილენის ლურჯს შეუძლია მომწიფებულ ლაბორატორიულ პირის ღრუს თანასაზოგადოებაში მეტაბოლიზმისა და დნმ-ზე დაფუძნებული რაოდენობის შემცირება მისი განადგურების გარეშე; ამ პირობებში მეტაბოლური ეფექტის უდიდეს ნაწილს მხოლოდ სინათლე იწვევს. ფოტოაქტივირებულ, ციკლოდექსტრინით გადატანილ საღებავს შეუძლია ახალგაზრდა ლაბორატორიულ სტრეპტოკოკურ ბიოფილმში სიცოცხლისუნარიანი მიკროორგანიზმების რაოდენობა რამდენიმე რიგით შეამციროს, იმავე მოდელში ქლორჰექსიდინის მსგავს დონემდე. ვრცელდება თუ არა რომელიმე დაკვირვება ადამიანში ინფექციაზე, დამოკიდებულია მიწოდებაზე, სინათლის შეღწევაზე, ჟანგბადზე, ანატომიასა და კლინიკურ შედეგობრივ მაჩვენებლებზე, რომელთა გასაზომადაც ეს ექსპერიმენტები არ ყოფილა დაგეგმილი.