E. coli-სა და სხვა კოლონიების გარეგნული ნიშნების წაკითხვა EMB აგარზე

სტუდენტი უცნობ ნიმუშს ეოზინ-მეთილენის ლურჯის აგარზე შტრიხული მეთოდით თესავს, ღამით ინკუბაციაზე ტოვებს და მეორე დღეს ფინჯანში მუქ კოლონიებს მწვანე ბზინვარებით ხედავს. ლაბორატორიულ რვეულში წერს: „E. coli, დადასტურებულია“. ეს ჩანაწერი იმაზე მეტს ამტკიცებს, ვიდრე ფინჯნის შედეგი იძლევა. ფინჯანი აჩვენებს ზრდისა და ფერმენტაციის ფენოტიპს კონკრეტულ პირობებში. სახეობის იდენტობის დადგენა ცალკე დასკვნაა და ცალკე მტკიცებულებას მოითხოვს.

ეს გზამკვლევი EMB აგარის შედეგებს ინტერპრეტაციის ამოცანად განიხილავს. იგი ხსნის მეთოდის საფუძველს, წარმოგიდგენთ ფინჯნების საილუსტრაციო ატლასს საკონტროლო ნიმუშებით და ასახელებს შემთხვევებს, როდესაც სახელმძღვანელოში აღწერილი სურათი შეცდომაში შეგიყვანთ.

ფინჯნის მოქმედების პრინციპი

EMB აგარი ერთდროულად სელექციური და დიფერენციულია. საღებავები ეოზინი Y და მეთილენის ლურჯი თრგუნავს მრავალ გრამდადებით ორგანიზმს, ამიტომ გარემო გრამუარყოფითი ორგანიზმების ზრდას უწყობს ხელს. იგივე საღებავები ინდიკატორების ფუნქციასაც ასრულებს: როდესაც ორგანიზმი ხელმისაწვდომ შაქარს აფერმენტირებს და ადგილობრივად საკმარის მჟავას წარმოქმნის, კოლონია დიდი რაოდენობით საღებავს ითვისებს და მუქ იისფერს ან ლურჯ-შავ ფერს იღებს. მჟავას ინტენსიური წარმოქმნისას კოლონიის ზედაპირზე შეიძლება მეტალური მწვანე ირისაცია გამოჩნდეს. ASM-ის პროტოკოლი ეოზინ-მეთილენის ლურჯის აგარის ფინჯნებისთვის აღწერს სელექციისა და დიფერენციაციის ამ კომბინაციას და სწავლებისთვის საცნობარო ფოტოსურათებს გვთავაზობს.

ნებისმიერი შედეგის წაკითხვამდე ერთი დეტალი მნიშვნელოვანია: შეამოწმეთ, რომელ ფორმულაციას იყენებთ. ძველი Holt Harris Teague-ის ფორმულაცია ლაქტოზასა და საქაროზას შეიცავს, ხოლო Levine EMB მხოლოდ ლაქტოზას შეიცავს. ორგანიზმი, რომელიც საქაროზას აფერმენტირებს, მაგრამ ლაქტოზას — არა, მაგალითად, Serratia marcescens-ის მრავალი იზოლატი, ამ ორ ვერსიაზე შეიძლება განსხვავებულად გამოიყურებოდეს. EMB გარემოების მწარმოებლის დოკუმენტაცია ფორმულაციებს შორის ამ განსხვავებას პირდაპირ მიუთითებს. შედეგთან ერთად რვეულში მწარმოებელი და ფორმულაციაც ჩაიწერეთ.

მომზადებული, დაუთესავი EMB აგარი ჩვეულებრივ მოწითალო-მოყავისფრო ან მოწითალო-მოიისფროა, ზოგჯერ მომწვანო ელფერით ან წვრილი ნალექით. ეს ფონური ფერი ზრდას არ ნიშნავს. ყოველი შეფასებისას შედეგი დაუთესავ ფინჯანს ან დოკუმენტირებულ საწყის მდგომარეობას შეადარეთ და პირველადი ფინჯანი დაახლოებით 18-დან 24 საათამდე აერობული ინკუბაციის შემდეგ, 35-დან 37 C-მდე ტემპერატურაზე შეაფასეთ, თუ სასწავლო პროტოკოლი სხვაგვარად არ მიუთითებს. გახანგრძლივებულმა ინკუბაციამ შეიძლება ფერმენტაციის გარეგნული ნიშნები შეცვალოს.

როგორ დაათვალიეროთ ფინჯანი

გამოიყენეთ ორი სახის განათება. ჯერ ფინჯანი არეკლილ ან ირიბად დაცემულ სინათლეზე დაათვალიერეთ და დახარეთ: მეტალური ბზინვარება ირისაციულია და ხედვის კუთხის მიხედვით შეიძლება გამოჩნდეს ან გაქრეს. შემდეგ გამავალი სინათლით შეაფასეთ კოლონიის ფერი და მუქი ცენტრები. იმუშავეთ კარგად განცალკევებულ კოლონიებზე, რადგან სიმჭიდროვე და მეზობელი კოლონიები მჟავას ადგილობრივ დაგროვებას ცვლის და ფერს შეიძლება ასუსტებდეს ან აძლიერებდეს. ASM-ის გამოსახულებების კრებული ამას პირდაპირ აჩვენებს: შერეულ კულტურაში E. coli-მ შეიძლება მოსალოდნელი ბზინვარება დაკარგოს, რადგან გარშემო არსებული ორგანიზმები მჟავიანობის პირობებს ცვლის.

როდესაც სავარჯიშო ამის საშუალებას იძლევა, ჩართეთ საკონტროლო ნიმუშები. გავრცელებული სასწავლო ნაკრები მოიცავს E. coli ATCC 25922-ს ლურჯ-შავი ფერისა და მეტალური ბზინვარების ფენოტიპისთვის, არაფერმენტირებელ ორგანიზმს, როგორიცაა Salmonella Typhimurium ATCC 14028 ან Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, უფერო ფენოტიპისთვის, და გრამდადებით ორგანიზმს, როგორიცაა Enterococcus faecalis ან Staphylococcus aureus, ინჰიბიციის კონტროლისთვის, როგორც ეს EMB გარემოების ხარისხის კონტროლის სტანდარტულ ცხრილებშია ჩამოთვლილი. თუ დადებით საკონტროლო ნიმუშს ბზინვარება არ აქვს, უცნობ ნიმუშზე ეჭვის მიტანამდე ინკუბაცია, კოლონიების სიმჭიდროვე ან ფორმულაცია გადაამოწმეთ.

ფინჯნების საილუსტრაციო ატლასი

ქვემოთ მოცემული ფინჯნები გენერირებული ილუსტრაციებია და არა რეალური კულტურების ფოტოსურათები. ისინი აჩვენებს ნიშნების ტიპურ ერთობლიობას, რომელიც უნდა ეძებოთ, და არა რომელიმე კონკრეტული შტამის ზუსტ ფერს. შეადარეთ ისინი ASM-ის საცნობარო ფოტოსურათებს და სასწავლო ლაბორატორიის რეალურ ფინჯნებს.

ფინჯანი 1: Escherichia coli EMB აგარზე, ლაქტოზის ინტენსიურად მაფერმენტირებელი ორგანიზმი

EMB აგარზე E. coli ჩვეულებრივ მუქი იისფერიდან ლურჯ-შავამდე შეფერილობისაა, ხშირად მუქი ცენტრითა და მჟავას ინტენსიური წარმოქმნით გამოწვეული მეტალური მწვანე ბზინვარებით. ეს ბზინვარება ის ცნობილი ნიშანია, რომელსაც სტუდენტები ეძებენ, თუმცა იგი დამხმარე მტკიცებულებად უნდა მიიჩნიოთ და არა განმსაზღვრელ კრიტერიუმად. ბზინვარების ინტენსივობა დამოკიდებულია შტამზე, ინკუბაციის ხანგრძლივობაზე, კოლონიების სიმჭიდროვესა და ხედვის კუთხეზე. ბზინვარების არარსებობა E. coli-ს არ გამორიცხავს, ხოლო მუქი კოლონია ბზინვარების გარეშე რამდენიმე სხვა მაფერმენტირებელ ორგანიზმზეც მიანიშნებს. ნებისმიერი შემდგომი სამუშაოსთვის შეარჩიეთ კარგად განცალკევებული კოლონია და არა მჭიდროდ გაზრდილი სექტორი.

ფინჯანი 2: Klebsiella pneumoniae EMB აგარზე, ლორწოვანი მაფერმენტირებელი ორგანიზმი

EMB აგარზე Klebsiella pneumoniae ჩვეულებრივ წარმოქმნის დიდ, პრიალა, ლორწოვან კოლონიებს ვარდისფერ-მოიისფროდან მოყავისფრო-მოიისფრო შეფერილობამდე, ხშირად მუქი ცენტრებით, მაგრამ, როგორც წესი, ძლიერი მეტალური ბზინვარების გარეშე. მსგავსი მორფოლოგია გვხვდება მონათესავე მაფერმენტირებელ ორგანიზმებშიც, მაგალითად, Enterobacter-ში. ლორწოვანი ტექსტურა და კოლონიის ზომა შეფასების ნაწილია: პატარა და ბრტყელ ვარდისფერ კოლონიას განსხვავებული ინტერპრეტაციული მნიშვნელობა აქვს, ვიდრე დიდ, გუმბათისებრ ლორწოვან კოლონიას. როგორც E. coli-ს შემთხვევაში, ფინჯანი ფერმენტაციის ფენოტიპზე მიანიშნებს, ხოლო სახეობის დონეზე დასახელებას ქვემოთ აღწერილი ბიოქიმიური დადასტურება სჭირდება.

ფინჯანი 3: Salmonella EMB აგარზე და სხვა არაფერმენტირებელი ორგანიზმები, უფერო კოლონიები

EMB აგარზე Salmonella და ლაქტოზის სხვა არაფერმენტირებელი ორგანიზმები, მათ შორის Shigella და Pseudomonas-ის მრავალი იზოლატი, ჩვეულებრივ უფერო, ნახევრადგამჭვირვალე ან ღია ქარვისფერ კოლონიებად იზრდება. ზოგი ფორმულაცია და პირობა სუსტ მოვარდისფრო ელფერს იძლევა, ამიტომ ღია ვარდისფერი კოლონია ავტომატურად მაფერმენტირებელ ორგანიზმს არ ნიშნავს. EMB ვერ განასხვავებს Salmonella-ს Shigella-სგან ან სხვა არაფერმენტირებელი ორგანიზმებისგან; ეს განსხვავება შემდგომი ტესტებით უნდა დადგინდეს. ასევე გაითვალისწინეთ, რომ დოკუმენტირებულია ლაქტოზადადებითი Salmonella-ს შტამები E. coli-ს მსგავსი მეტალურად მბზინავი კოლონიებით, რაც კიდევ ერთი მიზეზია იმისა, რომ მხოლოდ ერთი ფინჯნით საბოლოო დასკვნას ვერ გამოიტანთ.

ფინჯანი 4: Serratia marcescens და ფორმულაციით გამოწვეული შეცდომის საფრთხე

Serratia marcescens ცალკე განყოფილებას იმსახურებს, რადგან სტუდენტები ხშირად წითელ კოლონიებს ელიან და შემდეგ ფინჯანს არასწორად აფასებენ. კლინიკური იზოლატების უმეტესობა ლაქტოზას არ აფერმენტირებს, ამიტომ Levine EMB-ზე ისინი ხშირად ფერმკრთალი ან სუსტად შეფერილია. რადგან მრავალი იზოლატი საქაროზას აფერმენტირებს, საქაროზის შემცველმა ფორმულაციამ შეიძლება უფრო მუქი შეფერილობა ან მჟავას წარმოქმნასთან მეტად დაკავშირებული რეაქცია გამოიწვიოს. ნურც კლასიკურ წითელ პიგმენტ პროდიგიოზინს ელოდებით 35-დან 37 C-მდე ტემპერატურაზე; ინკუბატორის ტემპერატურაზე პიგმენტის წარმოქმნა არასტაბილურია. როდესაც პროტოკოლი EMB აგარზე Serratia marcescens-ს ახსენებს, შეამოწმეთ, რომელ ფორმულაციას გულისხმობს ეს აღწერა. Serratia-ს მეტაბოლიზმის მიმოხილვა აჯამებს ლაქტოზის მიმართ უარყოფით და საქაროზის მიმართ ცვალებად რეაქციებს, რომლებიც ამ შეცდომის საფრთხეს განაპირობებს.

ფინჯანი 5: საკონტროლო ნიმუშები და ინჰიბირებული ორგანიზმები

გრამდადებითი ორგანიზმები, როგორიცაა Staphylococcus, Enterococcus, Streptococcus და Bacillus, EMB აგარზე, როგორც წესი, ინჰიბირდება ან მათი ზრდა მნიშვნელოვნად ითრგუნება, თუმცა ინჰიბიცია ყველა შტამისთვის აბსოლუტური არ არის. საკონტროლო ნიმუშების ნაკრები შეფასებას სანდოს ხდის: E. coli-ს საკონტროლო ნიმუშმა უნდა აჩვენოს კარგი ზრდა ლურჯ-შავი შეფერილობითა და ბზინვარებით, არაფერმენტირებელი ორგანიზმის საკონტროლო ნიმუშმა — უფერო ზრდა, ხოლო ინჰიბიციის საკონტროლო ნიმუშმა — მცირე ზრდა ან ზრდის არარსებობა. თუ ინჰიბიციის საკონტროლო ნიმუში კარგად იზრდება, სელექციის ეტაპი არ მუშაობს და ამ პარტიაზე ყველა სხვა შეფასებაც საეჭვოა. შეღებვის მეთოდები და საკვები გარემოები სხვადასხვა კითხვას პასუხობს; ლაბორატორიაში სასაგნე მინაზე შეღებვის შესახებ იხილეთ მეთილენის ლურჯით შეღებვის ატლასი.

შედარება დასკვნების საზღვრების გათვალისწინებით

შეცდომაში შემყვანი გარეგნული ნიშნები სამი წინადადებით შეიძლება შევაჯამოთ. მუქი ფერი E. coli-ს არ უდრის, რადგან Klebsiella-ს, Enterobacter-სა და სხვა მაფერმენტირებელ ორგანიზმებს მუქი ცენტრები ბზინვარების გარეშეც უვითარდება. ვარდისფერი Klebsiella-ს არ უდრის, რადგან ზომიერად ან ნელა მაფერმენტირებელი ორგანიზმები და ზოგი ჩვეულებრივ არაფერმენტირებლად მიჩნეული ორგანიზმი ვარდისფრად ან ღია იისფრად გამოიყურება. ბზინვარება E. coli-ს საბოლოო დადასტურებას არ უდრის, რადგან მისი წარმოქმნა სხვა ინტენსიურად მაფერმენტირებელ ორგანიზმებსაც შეუძლია. სასწავლო პროტოკოლი და მასში მოცემული შერეული კულტურების გამოსახულებები თითოეულ ამ მცდარ დასკვნას ასახავს.

დადასტურების შეზღუდვები

EMB აგარი ფენოტიპს აჩვენებს და არა სახეობას. სხვადასხვა ორგანიზმს შეიძლება კოლონიის ერთნაირი გარეგნული ნიშნები ჰქონდეს, ხოლო ერთმა ორგანიზმმა სახელმძღვანელოში აღწერილი სურათისგან გადახვევა გამოავლინოს შტამის, ასაკის, კოლონიების სიმჭიდროვის, ფორმულაციისა და ინკუბაციის მიხედვით. ამიტომ სასწავლო და კლინიკურ სამუშაო პროცესებში EMB-ზე მორფოლოგიას წინასწარი იდენტიფიკაციის ნიშნად განიხილავენ.

სტუდენტისთვის დასაბუთებული სამუშაო პროცესი ასეთია: აღწერეთ განცალკევებული კოლონია — ზომა, ფერი, ცენტრი, ბზინვარება ირიბად დაცემულ სინათლეზე, ლორწოვანი ხასიათი; ჩაიწერეთ ფორმულაცია, ინკუბაციის ხანგრძლივობა და ტემპერატურა, ასევე საკონტროლო ნიმუშები; შემდეგ, ნებისმიერი დამადასტურებელი ტესტის ჩატარებამდე, კარგად განცალკევებული კოლონიიდან გადათესვით მიიღეთ სუფთა კულტურა. გავრცელებული შემდგომი კვლევებია გრამის წესით შეღებვა და IMViC რეაქციები E. coli-სა და კოლიფორმული ბაქტერიების სავარაუდო იდენტიფიკაციისთვის, TSI ან KIA და ორგანიზმისთვის სპეციფიკური ბიოქიმიური ტესტების პანელები ნაწლავური ორგანიზმებისთვის; საჭიროების შემთხვევაში გამოიყენება სეროლოგიური, MALDI TOF ან სხვა ვალიდირებული საიდენტიფიკაციო მეთოდები. იმის გასაგებად, თუ რა ადგილი უკავია EMB-ს ნაწლავური ორგანიზმების სელექციურ და დიფერენციულ გარემოებს შორის, იხილეთ ნაწლავური ორგანიზმების საკვები გარემოების შესავალი მასალები და გრამის წესით შეღებვის შემდგომი კვლევა. მონათესავე საკითხზე — რა შეიძლება და რა არ შეიძლება დაამტკიცოს სასაგნე მინის პრეპარატის ლურჯმა შეღებვამ — მეთილენის ლურჯით შეღებვის ატლასი იმავე პრინციპით მიჯნავს დაკვირვებასა და დასკვნას.

ჯერ დაკვირვება ჩაიწერეთ და შემდეგ — დასკვნა. „Levine EMB-ზე 24 საათის შემდეგ მუქი ლურჯ-შავი კოლონიები ხედვის კუთხეზე დამოკიდებული მწვანე ბზინვარებით, რაც ლაქტოზის ინტენსიურ ფერმენტაციას შეესაბამება“ დასაბუთებული ჩანაწერია. „E. coli, დადასტურებულია“ მოითხოვს დადასტურების იმ ეტაპს, რომელსაც მხოლოდ ფინჯანი ვერ უზრუნველყოფს.