Uji ragi nganggo metilena biru: ngetung sel urip utawa ngukur wektu respirasi

Ana rong tabung ing meja laboratorium. Loro-lorone biru. Ing tabung siji, sel biru sing katon ing mikroskop tegese ragi mati. Ing tabung sijine, owah-owahan saka biru dadi tanpa warna tegese ragi isih urip lan nindakake respirasi. Pewarnane padha, nanging makna asile kosok balen. Yen rong uji iki dianggep padha, kabeh dudutan bakal kuwalik.

Bedane iki dadi pokok kabeh artikel. Metilena biru iku pewarna redoks: nalika kaoksidasi, wernane biru; nalika kareduksi, dadi leukometilena biru sing tanpa warna. Pangetungan viabilitas nggunakake sipat kimia iki ing pengamatan mikroskopis sedhela. Eksperimen respirasi nggunakake sipat iki ing reaksi kabeh campuran sing wektune diukur. Saben uji butuh protokol dhewe, kontrol dhewe, lan sikap kritis dhewe.

Pangetungan viabilitas: pewarnaan sedhela, enggal diwaca

Protokol gaya pabrik bir iku versi sing paling dibakukan. Siapake metilena biru 0.01% w/v ing natrium sitrat 2%, campur kanthi rasio 1:1 karo suspensi ragi, banjur priksa campuran sawise interval cendhak sing wis ditemtokake. Interval ing publikasi beda-beda, saka 1 nganti 2 menit ing buku pandhuan Brewing Science Institute nganti watara 5 menit ing protokol riset, dene metode mikrobiologi anggur OIV mbutuhake pamriksan sajrone 10 menit. Konsentrasi pewarna ing campuran pangetungan pungkasane watara 0.005%. Lebokake ing kamar Neubauer sing wis disempurnakake, lan ing pembesaran watara 400x, golongake sel biru tuwa minangka ora viabel lan sel sing ora kewarna minangka viabel. Sel biru enom dianggep urip ing metode OIV, sing wis menehi pratandha babagan masalah subyektivitas sing dirembug ing ngisor.

Konsentrasi sel ditemtokake saka geometri kamar. Yen kabeh kothak tengah sing sisine 1 mm dietung, cacah sel saben mL padha karo N dikali faktor pengenceran dikali 10^4, kanthi N minangka cacah ing area kasebut, kaya diterangake ing metode ragi ASBC. Viabilitas luwih prasaja: cacah sel sing ora kewarna dipara cacah kabeh sel, banjur dikali 100. Etunga watara 400 sel kanggo ngira viabilitas, miturut panaliten perbandingan pabrik bir FEMS lan praktik OIV. Gunakake siji aturan wates kanthi ajeg, upamane nyakup sel ing garis kisi ngisor lan kiwa, nanging ora nyakup sel ing garis ndhuwur lan tengen.

Aturan kanggo tunas kudu ditemtokake sadurunge pangetungan diwiwiti. Paugeran sing umum ngetung tunas minangka sel kapisah yen ukurane wis watara separo ukuran sel induk; yen luwih cilik, tunas dietung bebarengan karo induke. Apa wae aturan sing dipilih, terapna ing saben kothak lan tulisen ing lembar pangetungan supaya wong sabanjure bisa nindakake kanthi cara sing padha.

Lembar pangetungan (cithaken iki)

Lembar pangetungan iki minangka materi asli kanggo artikel iki. Salinen ing buku cathetan utawa cithaken siji kanggo saben sampel.

Viability (%) = 100 x unstained / (unstained + dark blue). Total cells per mL = N x dilution factor x 10^4, kanthi N saka area kamar sing wis ditemtokake. Ing rumus iki, unstained tegese sel sing ora kewarna, dark blue tegese sel biru tuwa, lan dilution factor tegese faktor pengenceran. Catheten interval pewarnaan ing jejere asil, amarga angka viabilitas tanpa katrangan wektune ora bisa dibaleni kanthi asil sing padha.

Napa angka viabilitas bisa owah

Wektu minangka gangguan kapisan, lan pengaruhe bisa menyang rong arah. Sel sing aktif kanthi metabolik ngreduksi pewarna, mula pamacaan sing kesusu bisa nemokake sel urip sadurunge rampung ngreduksi pewarna lan kliru nggolongake minangka sel mati. Nanging paparan sing suwe dhewe nduweni sipat toksik lan ngasilake sel biru sing pancen rusak, mula katon kaya ana luwih akeh sel mati. Mula, sawijining protokol praktikum laboratorium nemtokake manawa pambiji kudu ditindakake sajrone 5 menit, kaya kacathet ing protokol praktikum ragi Wisconsin. Katrangan sing ngati-ati yaiku pambiji metilena biru gumantung marang wektu, mula temtokna siji interval cendhak lan tetepna padha kanggo saben sampel ing sawijining seri.

Sampel kanthi viabilitas sithik duwe bias kapindho. Metode sing dibakukan menehi pepeling manawa metilena biru bisa menehi prakiraan luwih dhuwur tinimbang viabilitas nyata yen viabilitas kurang saka watara 80%, amarga sel sing isih bisa ngreduksi pewarna durung mesthi isih bisa ngasilake sel anyar. Literatur pembuatan bir nerangake masalah linuwih sing padha nalika viabilitas mudhun banget. Anggepen metilena biru minangka cara cepet kanggo menehi prakiraan kasar, lan konfirmasikna kaputusan penting ing kahanan viabilitas sithik, kayata nggunakake kultur maneh kanggo fermentasi, nganggo pangetungan koloni ing cawan utawa pewarnaan pelengkap.

Pengaruh matriks minangka gangguan katelu. Metode OIV ditindakake ing pH watara 4.6 lan menehi pepeling manawa sampel pH sithik kanthi daya penyangga kuwat ngalangi pewarna tumindak kanthi bener. Metode iki uga menehi saran supaya uji ora digunakake ing kadar gula luwih saka 100 g/L, amarga sel katon biru enom sing bisa nyasarke. Perbandingan eksperimen babagan pH pewarnaan nemokake owah-owahan sensitivitas sing gedhe ing rentang sing diuji, cocog karo panaliten metode metilena biru sing gumantung marang pH. Rereged dadi jebakan liyane: partikel sing kewarna ing bubur bahan fermentasi sing reged bisa katon kaya sel mati lan nambah beda asil antaroperator.

Variabilitas iki wis diukur, dudu mung crita pengalaman. Ing uji pabrik bir suwene nem sasi sing dilapurake ing perbandingan ragi FEMS, pangukuran metilena biru duplikat nduweni simpangan baku rata-rata 6.1%, dibandhingake karo 0.2% kanggo sitometri aliran nganggo oxonol, lan rong operator bisa beda nganti 13 poin persentase ing sampel sing padha. Sawijining perbandingan kuantitatif metode viabilitas taun 2023 nemokake manawa mikroskopi fluoresensi lan sitometri aliran luwih presisi, lan uga nuduhake manawa kinerja gumantung marang spesies lan matriks. Andharan metode klasik dening Painting lan Kirsop (PMID 24430080) isih dadi rujukan, lan tinjauan uji viabilitas lan vitalitas ragi (PMID 25154541) sing luwih jembar nempatake metilena biru minangka uji pelengkap, dudu uji sing nemtokake asil pungkasan. Biru tripan ora kanthi otomatis dadi pilihan sing luwih apik ing kene: pewarna iki nuduhake ilange integritas membran, dene metilena biru nuduhake penyerapan pewarna lan aktivitas reduksi, mula sel sing ngalami stres bisa digolongake kanthi beda nganggo rong pewarna kasebut.

Eksperimen respirasi: ukur wektu nganti warna biru ilang

Uji kapindho ora nggunakake mikroskop babar pisan. Ragi, glukosa, lan metilena biru encer dilebokake ing tabung katutup, banjur jam ngukur suwene wektu nganti warna biru ilang. Nalika sel nindakake metabolisme, sel ngasilake ekuivalen pereduksi sing ngowahi pewarna biru dadi wujud tanpa warna, dene oksigen larut ngoksidasi maneh dadi biru. Sawise sel nyuda kadar oksigen, reduksi neto dadi luwih dominan lan warna ing tabung ilang. Mula, titik pungkasan nggambarake imbangan antarane respirasi, konsentrasi pewarna, lan kasedhiyan oksigen, lan kudu dilapurake minangka wektu reduksi utawa ilange warna metilena biru, dudu minangka laju langsung konsumsi oksigen molekuler.

Gunakake pewarna sing luwih encer tinimbang kanggo uji viabilitas supaya wektu pangukurane ana ing rentang sing trep. Buku pandhuan praktikum wajib AQA A level mbakukan iki kanthi becik: 1 g glukosa saben 100 mL banyu sing diangetake nganti watara 30 C, 5 g ragi garing ditambahake pas sadurunge digunakake, lan larutan pewarna kerja watara 0.001% digawe kanthi ngencerake 0.1 mL larutan stok 1% nganti 100 mL. Campur 2 mL suspensi ragi-glukosa karo 2 mL larutan pewarna kerja, enteni nganti tekan suhu uji, goyangen sapisan suwene 10 detik, wiwiti pangukur wektu, lan aja digoyang maneh. Nggoyang bakal nglebokake oksigen maneh lan nggawe tabung bali biru; iki artefak prosedur sing paling gedhe. AQA nyathet manawa campuran biasane kudu ilang wernane sajrone watara 5 menit ing 35 C, kanthi rata-rata uji 275 s ing 20 C, 128 s ing 35 C, lan 145 s ing 45 C. Iki tuladha saka siji tata uji, dudu patokan universal. Sesambungan kuantitatif antarane laju reduksi lan ragi sing aktif kanthi metabolik ing kahanan sing dikontrol didhukung panaliten khusus babagan reduksi, kalebu karya sing diindeks minangka PMID 25773544 lan panaliten mekanisme ing Yeast (2014).

Demonstrasi owah-owahan miturut wektu (materi asli)

Tabel ing ngisor iki minangka demonstrasi asli sing digawe kanggo artikel iki nganggo tata uji gaya AQA sing diterangake ing ndhuwur: 2 mL campuran ragi-glukosa lan 2 mL larutan pewarna kerja watara 0.001%, digoyang sapisan suwene 10 detik, banjur diinkubasi tanpa diganggu. Isine minangka tuladha pamacaan kanthi format sing kudu dicathet kelompok siswa, kanthi indeks laju ditetepake minangka 1 dipara wektu ilange warna ing detik. Tindakna uji nganggo tabung sing padha lan gantinen isian iki nganggo nilai pangukuran nyata.

Gawe grafik indeks laju marang suhu kanggo tabung A, B, lan C. Kurvane munggah banjur dadi rata utawa mudhun, yaiku pola sing diarepake saka proses sing didorong enzim, dudu garis lurus. Tabung D, E, lan F dudu titik data ing kurva kasebut. Tabung-tabung iki minangka kontrol sing nggawe kurva bisa ditegesi.

Kontrol sing nggawe saben uji nduweni makna

Saben uji respirasi butuh telung kontrol panyerta. Ragi sing digodhog utawa dipateni, ditambah glukosa lan pewarna, kudune tetep biru, kanggo mbuktekake manawa reduksi cepet gumantung marang metabolisme sel urip. Ragi urip lan pewarna tanpa tambahan glukosa minangka kontrol substrat, nanging warna isih bisa ilang alon amarga ragi nggunakake cadangan endogen. Glukosa lan pewarna tanpa ragi minangka blangko kimia, sing penting amarga glukosa ing kahanan basa bisa ngreduksi metilena biru sanajan ora ana sel.

Pangetungan viabilitas butuh jinis kontrol sing beda: prosedur sing ajeg. Gunakake larutan stok pewarna sing padha, rasio campuran sing padha, interval pewarnaan sing padha, area kamar sing padha, sarta aturan tunas lan wates sing padha; yen bisa, etunga tanpa ngerti identitas utawa kahanan sampel. Nalika asil rong operator beda sepuluh poin, lembar pangetungan biasane nuduhake sababe: wektu sing beda, ambang warna biru sing beda, utawa aturan tunas sing beda. Teknik nyiapake lan ndeleng sel sing diwarnai ana gandhengane karo metode pewarnaan bakteri prasaja, dene ringkesan sing luwih jembar babagan apa sing ditandhani pewarna iki ing macem-macem spesimen ana ing atlas pewarnaan mikroskopi. Kanggo dhasar fisika pamacaan intensitas biru kanthi kuantitatif, rujukan absorpsi kanthi katrangan kahanan nerangake napa saben koefisien kudu dibarengi katrangan pelarut, pH, lan kahanan konsentrasine.

Pilihen uji manut pitakone. Pira sel sing isih urip saiki iku pitakon pangetungan, sing dijawab nganggo mikroskop lan lembar pangetungan. Sepira aktife kultur iki nindakake respirasi iku pitakon kinetika, sing dijawab nganggo stopwatch lan tabung sing dikontrol. Metilena biru bisa digunakake kanggo loro-lorone, nanging ora tau ing tabung sing padha ing wektu sing padha.