Metilen biru kanggo pewarnaan DNA lan RNA: panggunaan ing gel lan membran

Sawijining mahasiswa nglakokake gel agarosa, menehi warna nganggo metilen biru, lan ora weruh apa-apa ing panggonan sing dikarepake ana pita padhang. Ing meja laboratorium jejere, sawijining peneliti pascadoktoral menehi warna membran Northern nganggo botol biru sing padha lan oleh pita ribosomal sing cetha sajrone telung menit. Mahasiswa mau nyimpulake yen gele gagal. Gele ora gagal. Rong tugas mau beda, lan pewarna sing padha menehi asil kanthi sensitivitas, latar mburi, lan aturan kanggo langkah sabanjure sing beda.

Pewarnaan DNA nganggo metilen biru lan pewarnaan RNA nganggo metilen biru nduweni kimia sing padha, nanging tujuane beda. Ing gel, pewarna nuduhake sepira akehe asam nukleat sing ana ing matriks berpori. Ing membran, pewarna nuduhake apa transfer kasil lan apa saben lajur diisi kanthi rata. Sawise bedane iki cetha, protokol, wates deteksi, lan wates kompatibilitas luwih gampang dimangerteni.

Wangsulan cekak

Metilen biru yaiku pewarna kationik planar sing ngiket asam nukleat kanthi nonkovalen lan bisa dibalekake, liwat gabungan daya tarik elektrostatik marang fosfat, interkalasi ing antarane pasangan basa, lan asosiasi karo alur minor. Sipat sing bisa dibalekake iki dadi inti panggunaane. Pita bisa diwenehi warna, dideleng nganggo cahya katon, didokumentasikake, banjur diilangi warnane utawa diresiki kanggo kloning, hibridisasi, utawa probing maneh.

Kanggo pewarnaan DNA untai ganda ing gel agarosa nganggo metilen biru, resep cepet standar yaiku 0.02 percent w/v (200 micrograms per mL) ing banyu, watara 15 menit pewarnaan ditambah watara 15 menit ngilangake warna nganggo banyu, banjur dideleng ing kothak cahya putih. Kanggo membran, resep klasik blot Northern yaiku pewarna 0.02 nganti 0.04 percent ing natrium asetat cedhak pH 5.2, pewarnaan sawetara menit sawise transfer lan imobilisasi, banjur dibilas nganggo banyu lan warnane diilangi nganti tuntas sadurunge hibridisasi. Sensitivitase winates: puluhan nganti atusan nanograms saben pita gel ing kahanan sing apik, lan pandhuan konservatif nyebut 0.5 nganti 1 microgram. Nilai iki pirang-pirang orde magnitudo luwih dhuwur tinimbang pewarna etidium bromida lan SYBR. Ing membran, ora ana siji wates deteksi transkrip sing migunani amarga pewarna utamane nuduhake RNA ribosomal sing akeh lan sakabehe bahan sing dimuat. Aja ngganti bahan ing resep loro mau nganggo larutan suplemen eceran. Metode sing wis divalidasi nggunakake pewarna kelas analitik, bufer kanthi komposisi sing ditemtokake, lan penanganan bebas RNase yen ana RNA.

Cara pangiketan lan kahanan sing bisa nyasarke

Model sing migunani nduweni telung bagean. Sepisan, sistem cincin sing muatane positif ketarik marang balung mburi fosfat sing muatane negatif. Panaliten spektroskopi nemokake yen komponen elektrostatik iki dominan nalika kadar uyah kurang, dene pemodelan lan dinamika molekuler nuduhake interkalasi lan pangiketan alur minor minangka mode sing stabil kanggo DNA untai ganda, kaya diringkes ing panaliten spektroskopi babagan pangiketan metilen biru karo DNA. Kapindho, ana sawetara preferensi marang GC, kanthi pemodelan luwih milih langkah CpG lan GpC, lan eksperimen nglaporake asosiasi sing luwih disenengi karo dupleks sing sugih GC ing panaliten babagan preferensi interkalasi metilen biru, nanging dupleks AT uga bisa ngiket. Pewarnaan rutin ora spesifik marang urutan basa. Katelu, DNA untai tunggal lan RNA utamane ngiket liwat elektrostatika lan tumpukan karo basa sing bisa diakses lan wilayah dupleks. Mula, kekuwatan pewarnaan beda-beda miturut dawa, urutan basa, lan struktur sekunder.

Ana rong akibat. Amarga pangiketan iku nonkovalen, pewarna bisa kaumbah metu. Pita poliakrilamida cepet luntur kajaba sengaja difiksasi, lan varian fiksasi permanen khusus pancen ana amarga pewarnaan lumrah mung sauntara, kaya diterangake dening Soto lan Draper kanggo gel PAGE. Amarga pewarna iki fotosensitiser, DNA sing wis diwenehi warna lan kena cahya padhang suwe nalika ana oksigen bisa ngalami oksidasi guanin lan pungkasane pedhot lokal ing untai, sawijining mekanisme sing diterangake kanthi rinci ing panaliten babagan oksidasi guanin sing disensitisasi metilen biru. Ndeleng sedhela nganggo cahya putih bisa nyingkiri karusakan UV sing wis kondhang ing alur kerja klasik etidium bromida, lan kauntungan iki nyata kanggo pemulihan preparatif. Cahya katon luwih alus, nanging tetep bisa ngrusak. Watesi wektu panyinaran yen DNA arep dikloning. Kanggo fotokimia sing luwih jembar sing dadi dhasar pancegahan iki, delengen rong jalur ing fotokimia metilen biru. Kanggo pasangan redoks lan kahanan muatan sing nerangake kenapa wujud teroksidasi bisa ngiket lan wujud tereduksi ora bisa, delengen kimia struktur lan sipat metilen biru.

Tugas kapisan: pewarnaan ing njero gel

Pewarnaan gel mangsuli siji pitakon: apa asam nukleat ing pita iki cukup akeh supaya bisa katon nganggo mripat. DNA untai ganda ing agarosa yaiku kasus sing paling rinci ditliti. Metode gel metilen biru asli saka Flores lan kanca-kancane ngesahake protokol cepet 0.02 percent ing agarosa 1 percent lan nuduhake pemulihan lan kloning sing kasil sawise iku. Protokol pemasok sing padha ana ing kaca produk metilen biru IBI Scientific, sing nampilake resep membran 0.04 percent lan varian gel cepet kanthi jejer.

Alur kerja praktis:

1. Lakokake gel kaya lumrahe. Wenehana warna sawise elektroforesis, dudu sajrone elektroforesis, kajaba transfer utawa resolusi wis divalidasi kanggo metode sing diowahi.
2. Rendhem ing metilen biru 0.02 percent w/v ing banyu suling, kanthi digoyang alon, watara 15 menit.
3. Ilangi warna nganggo banyu sing diganti kaping pirang-pirang, total watara 15 menit, nganti warna latar mburi matriks mudhun lan pita katon cetha.
4. Enggal potret nganggo iluminator cahya putih.

Agarosa lan poliakrilamida nduweni prilaku sing beda. Agarosa nahan pewarna ing matriks, mula ngilangake warna dadi langkah sing alon. Gel poliakrilamida tipis cepet diwarnai, nanging uga cepet kelangan pewarna. Iki mbantu eksisi preparatif nanging nyuda mutu cathetan arsip. Panggonan oligonukleotida sintetis ing poliakrilamida bisa ditemokake nganggo resep 0.02 percent sing padha sajrone 20 nganti 30 menit kanthi pambasuhan banyu bola-bali, miturut metode PAGE gaya Current Protocols sing wis mapan. Varian sing encer banget, cedhak 0.0002 percent ing TBE encer, wis dilaporake kanggo oligo preparatif sajrone sawetara jam, nanging dhasar buktine luwih ringkih.

Bedane DNA lan RNA kudu digatekake. DNA untai ganda menehi pangiketan terstruktur sing paling kuwat. RNA lan DNA untai tunggal bisa diwarnai, nanging luwih ringkih lan asile luwih angel diprakirakake. Kanggo gel RNA agarosa formaldehida, umume laboratorium ora nindakake pewarnaan biru ing gel lan mindhah RNA menyang membran dhisik, banjur menehi warna ing kana. Pamindhahan iki ngganti sinyal gel sing ringkih dadi sinyal membran sing luwih cetha, sekaligus menehi cathetan pemuatan.

Tugas kapindho: pewarnaan ing membran

Pewarnaan membran mangsuli pitakon sing beda: apa transfer kasil, lan apa lajur-lajure bisa dibandhingake. Panggunaan klasik yaiku pewarna blot Northern sing bisa dibalekake saka Herrin lan Schmidt, sing wiwitane nggunakake pewarna 0.04 percent ing natrium asetat 50 mM ing pH 5.0 sajrone 2 nganti 3 menit kanthi pambilasan banyu, lan bisa diilangi nganggo SDS encer ing SSPE sadurunge hibridisasi.

Varian modern sing akeh digunakake nduweni langkah kaya mangkene:

1. Transfer RNA utawa DNA sing wis didenaturasi menyang nilon utawa nitroselulosa, banjur imobilisasi nganggo pengikatan silang UV utawa pemanasan supaya sampel ora ilang sajrone pewarnaan.
2. Opsional nanging lumrah: telesi membran ing asam asetat 5 percent watara 15 menit.
3. Wenehana warna sajrone 5 nganti 10 menit ing metilen biru 0.02 nganti 0.04 percent ing natrium asetat 0.3 nganti 0.5 M cedhak pH 5.2.
4. Bilas lan ilangi warna ing banyu sajrone 5 nganti 15 menit, dokumentasikake, banjur ilangi sisa pewarna sadurunge hibridisasi.

Nilon sing muatane positif paling akeh digunakake ing analisis Northern. Nitroselulosa uga bisa digunakake kanthi alur kerja asam asetat ditambah asetat sing padha. Gambar digunakake kanggo ngonfirmasi transfer, mbandhingake pita 28S lan 18S (utawa 23S lan 16S kanggo RNA bakteri), menehi tandha tangga ukuran lan standar, lan nyimpen cathetan normalisasi RNA total kanthi kasar. Metode Northern sing wis diterbitake ngukur pita ribosomal sing diwarnai kanggo mriksa pemuatan, kalebu panaliten ilmu persusuan sing nggunakake pita ribosomal metilen biru kanggo normalisasi. Membran Southern bisa divisualisasikake kanthi cara sing padha, nanging pewarna iki luwih mapan minangka pamriksa pemuatan lan transfer Northern. DNA Southern uga didenaturasi sadurunge transfer, mula angka sensitivitas gel ora bisa langsung ditrapake.

Wates deteksi lan latar mburi: kahanan nalika biru kalah

Perbandingan ing ngisor iki pancen digawe minangka perkiraan. Kinerja pewarna gumantung marang persentase gel, ambane pita, optik, lan ketlatenan ngilangake warna. Anggep saben angka minangka orde magnitudo, dudu spesifikasi.

Kontrol latar mburi nemtokake apa sinyal sing winates iki bisa digunakake. Pewarna bebas nduweni warna sing pekat, mula kontras diasilake kanthi ngilangake pewarna sing ora kaiket tanpa ngilangake pewarna sing kaiket. Pewarna sing luwih pekat arang nambah sensitivitas. Utamane mung nambah wektu ngilangake warna. Lakokake seri pengenceran ing gel, membran, lan kamera sing pancen digunakake, lan gunakake mung rentang nalika densitas terintegrasi tetep proporsional karo input. Metilen biru bisa digunakake kanggo normalisasi pemuatan semikuantitatif. Iki dudu uji kuantitatif kanthi rentang dinamis dhuwur amarga kapasitas membran, efisiensi transfer, saturasi, lan pangilangan warna beda-beda ing saben lajur.

Wates kompatibilitas: apa sing tetep bisa digunakake sawise pewarnaan

Kloning sawise pewarnaan biru wis dibuktekake. Flores lan kanca-kancane ngethok pita agarosa sing wis diwarnai, mbalekake DNA, banjur nindakake ligasi lan transformasi, lan nglaporake kloning sing luwih apik tinimbang sawise pewarnaan etidium bromida nganggo UV. Sebab sing paling mungkin yaiku karusakan cahya sing luwih sithik, dudu paedah saka pewarna dhewe. Watesi paparan cahya putih supaya cekak lan resiki DNA sing wis dibalekake nganggo prosedur ekstraksi gel lumrah.

Bukti kanggo PCR lan sekuensing luwih winates. Sisa pewarna ngiket asam nukleat, mula ilangi warna lan resiki sadurunge langkah enzimatik. DNA saka gel biru sing wis dimurnekake kanthi bener dikarepake bisa digunakake, nanging toleransi marang pewarna sing langsung kebawa ing macem-macem polimerase lan kimia sekuensing durung diukur kanthi apik. Aja nganggep mesthi kompatibel.

Hibridisasi blot kompatibel yen urutane dituruti kanthi ketat: transfer, imobilisasi, pewarnaan, dokumentasi, pangilangan warna, hibridisasi. Urutan iku rancangan Herrin lan Schmidt. Pewarnaan sadurunge transfer, utawa ngliwati pangilangan warna, yaiku metode sing beda lan mbutuhake validasi dhewe. Sawise pewarna diilangi, pangilangan probe lan probing maneh kanthi prosedur standar bisa diterusake kaya lumrahe. Kanggo pewarnaan ing tingkat sel nganggo kulawarga pewarna sing padha lan sebab logika preparat film sing difiksasi ora bisa ditrapake ing metode sel urip, delengen atlas pewarnaan mikroskopi.

Eksisi pita bisa ditindakake kanggo agarosa preparatif lan oligo PAGE sing panggonane ditemokake nganggo biru, anggere ora nggunakake varian fiksasi permanen. Elektroelusi sawise pangilangan warna masuk akal kanthi kimia kanggo bahan pengiket sing bisa dibalekake, nanging data asil pemulihan saka eksperimen terkontrol sing spesifik kanggo metilen biru isih sithik. Ilangi uyah utawa endhapake sawise elusi.

Kegagalan sing bola-bali kedadeyan

Pita gel sing samar biasane nuduhake massa sing sithik banget kanggo pewarna kolorimetrik, utamane kanggo target untai tunggal cekak utawa RNA. Tambahana muatan, gunakake pewarna anyar, dawaake wektu pewarnaan sadurunge nambah konsentrasi, lan endhegake pangilangan warna luwih awal. Gel biru pekat tanpa kontras biasane nuduhake pewarnaan kakehan utawa banyu kurang kerep diganti. Pita PAGE sing luntur yaiku prilaku kimia sing dikarepake, dudu pewarnaan sing gagal. Enggal potret. Latar mburi membran sing ora rata nuduhake lipatan, gelembung, bekas driji, goyangan sing ora rata, utawa transfer sing ora rata. Aja nginterpretasikake iki minangka pemuatan sing ora padha tanpa kontrol hibridisasi. Pola ribosomal sing samar lan mblobor bisa nuduhake degradasi, nanging uga bisa amarga transfer ora tuntas, RNA total sithik banget (lajur lumrah ngemot sawetara nganti puluhan micrograms), utawa pangilangan warna kakehan. Pewarna nuduhake RNA ribosomal sing akeh. Pewarna ora nuduhake transkrip tartamtu. Tugas iku dadi tugase probe.

Kaslametan lan penanganan tanpa klaim keluwihan

Metilen biru luwih gampang ditangani tinimbang etidium bromida, nanging tetep bisa mbebayani. Lembar data kaslametan MilliporeSigma saiki nggolongake pewarna iki minangka toksisitas oral akut Kategori 4, mbebayani yen diuntal, lan kudu dibuwang liwat jalur limbah sing disetujoni miturut SDS metilen biru Sigma-Aldrich. Etidium bromida nduweni peringatan genotoksisitas sing luwih kuwat, kalebu dugaan efek marang sel germinal ing SDS etidium bromida Sigma-Aldrich, lan gel sarta larutane lumrahe dipisahake minangka limbah kimia mbebayani kaya diterangake ing pandhuan pewarna asam nukleat Thermo Fisher. Turutana SDS lan aturan institusi kanggo loro-lorone. Simpen pewarna garing ing wadhah sing ditutup rapet lan tetep garing, gunakake maneh larutan pewarna kerja mung yen protokol ngidini, simpen membran sing wis diwarnai kanthi garing ing antarane lembar kertas saring, lan potret gel sadurunge pitane nyebar amarga difusi.

Elinga ukara kanggo meja laboratorium iki. Gel mriksa apa muatan dhuwur bisa katon ing cahya putih. Membran mriksa transfer lan pemuatan sadurunge probe nindakake deteksi sing sensitif. Siji pewarna bisa kanggo loro tugas mau, kanthi sensitivitas winates, pangiketan sing bisa dibalekake, lan urutan langkah sing ketat.