脳卒中と脳低灌流の研究におけるメチレンブルー：3つのモデルが実際に示すこと

閉塞した動脈、栄養を絶たれた培養細胞、頸部の動脈が狭くなったラットは、同じ実験の3つの形のように聞こえるかもしれません。しかし、そうではありません。それぞれが異なる問いを検証しており、メチレンブルーが示す結果も異なります。これらを混同すると、文献の結果は矛盾しているように見えます。区別すれば、主に投与のタイミングに左右される明確なパターンが見えてきます。

この区別こそが、本レビューの主眼です。対象とする3つのモデルは、急性局所性脳卒中、培養細胞における酸素・グルコース欠乏とその後の再酸素化、そして数週間にわたる慢性脳低灌流です。これらを結び付ける機序としてミトコンドリアの働きが提案されていますが、代謝の状況が異なるため、結果も異なります。

3つのモデルは異なる問いに答える

ラットの急性局所性脳卒中は、通常、中大脳動脈を閉塞させることで誘発します。これはMCAOと略されます。血栓に似た閉塞により虚血コアが形成され、その周囲にはペナンブラが生じます。ペナンブラとは、損傷の危険にさらされているものの、血流が回復すれば救済できる可能性がある組織です。ここでの問いは、介入によって梗塞の拡大を遅らせたり、再灌流の前後に機能を維持したりできるかどうかです。

酸素・グルコース欠乏はOGDと略され、これとは対照的に細胞レベルで検証します。培養した脳細胞を、グルコースがなく酸素がほぼゼロの環境に置いた後、通常の培地に戻します。血栓も、側副血行も、血圧も、免疫系もありません。問いは純粋に細胞に関するものです。代謝基質が失われ、その後再び供給されると、呼吸、ATP、生存に何が起こるかを調べます。

慢性脳低灌流では、ラットの両側頸動脈を永久閉塞させる2VOモデルを用います。前脳への血流が低下し、数週間にわたって低い状態が続きます。突然の局所的な梗塞も、緊急の再灌流もありません。問いは、長期間の低血流の間、数週間にわたる代謝の支援によって血管、ミトコンドリア、記憶を維持できるかどうかです。

したがって、2VOモデルで1か月の処置後に記憶が改善しても、緊急血栓回収術の際にヒトの脳を救済できるかどうかについて、直接示すものはありません。この区別は重要です。楽観的な要約の多くは、この点を省略しています。

急性脳卒中：再灌流時には保護、再灌流がなければ進行を遅延

急性モデルで最も明確な結果が得られているのは、再灌流を伴う一過性MCAOです。ラットに60分間の閉塞を行い、再灌流の開始時から低用量のメチレンブルーを静脈内投与し、3時間後と2日目にも追加投与しました。MRIでは、溶媒対照群の病変が2日目までに約19パーセント拡大したのに対し、投与群の病変は約17パーセント縮小しました。最終的な梗塞は約30パーセント小さく、2日目と7日目の神経学的スコアも良好でした。画像上では、虚血コアとペナンブラの両方で組織の生存が改善しました。神経保護に関するより広範な文献では、この再灌流時の保護作用が、全脳虚血や外傷に関する知見と併せて取り上げられています。

動脈が閉塞したままの場合、状況は変わります。永久MCAOの実験では、虚血が続いている間にメチレンブルーを投与すると、拡散強調画像上の病変の拡大が遅くなり、灌流・拡散ミスマッチの持続時間が一時的に延長し、局所血流もわずかに改善しました。しかし、24時間後の最終梗塞体積に有意差はありませんでした。損傷リスクのある組織が梗塞へ移行するのを遅らせたものの、血管の再開通に代わるものではありませんでした。

3つ目の急性モデルの研究は、機序と用量についてさらに詳しい情報を示しています。閉塞直後に単回腹腔内投与を行ったところ、1または10 mg/kgではなく、中間の5 mg/kgで約50パーセントという最大の梗塞縮小が認められ、感覚運動機能のスコアも良好でした。著者らは、この結果をミトコンドリア構造の維持と、損傷したミトコンドリアを選択的に除去するマイトファジーの増加に関連付けました。したがって、用量、投与経路、投与スケジュールは重要であり、ラットのmg/kg値はヒトの脳卒中に対する投与量ではありません。

細胞培養：同じ薬剤でも投与のタイミングによって有益にも有害にもなる

アストロサイトの実験は、最も示唆に富む一方で、最も誤って引用されている実験です。マウス大脳皮質由来の初代培養アストロサイトを、グルコース、ピルビン酸、血清を含まない培地で、酸素濃度0.1パーセントの厳しい欠乏状態に6時間置きました。その後、代謝基質を再び供給して24時間の再酸素化を行いました。細胞の約半数が死滅したため、この試験では有益な作用と有害な作用のどちらも検出できる余地がありました。

欠乏期にメチレンブルーが存在すると、生存は改善せず、悪化しました。一方、再酸素化の時点で添加すると、低マイクロモル濃度で細胞生存率が改善し、酸素消費、グルコース取り込み、ATP産生が増加しました。通常の条件下では、同じ濃度域でグルコース取り込みが増加し、0.1マイクロモルでは約89パーセント、1マイクロモルでは約200パーセント増えました。また、障害後のグリコーゲンとヘキソキナーゼ活性が維持され、スーパーオキシドの増加は測定されませんでした。

この機序は、予備の発電機に例えると理解しやすくなります。メチレンブルーは、還元当量を受け取り、シトクロムcと複合体IVへ渡す代替電子運搬体として働きます。これにより、上流での電子漏出を減らしながら、電子の流れとATP合成を支えます。厳しい欠乏状態では、この促進作用は不利に働きます。酸素とグルコースがほぼ存在しないときに代謝需要を高めるため、残されたエネルギーの蓄えをより早く使い果たす可能性があるからです。代謝基質の供給が回復した後には、同じ性質が利点になります。損傷したミトコンドリアが、再び供給された酸素とグルコースを効率よく利用するのを助けるからです。ミトコンドリアの電子伝達に関する解説で知見を取り上げる際に、欠乏状態という条件を併記する必要があるのも、このためです。

注意すべき点が1つあります。このタイミングに関する規則は、このアストロサイト実験の条件に限られます。関連する別の細胞研究では、異なる細胞種、より軽い欠乏状態、より低い濃度を用いたところ、欠乏期に曝露した場合でも保護作用が認められました。細胞種、残存酸素、濃度、実験手順によって、作用が有益か有害かが決まります。

慢性的な低血流：数週間にわたる記憶、シトクロムオキシダーゼ、血管の変化

慢性モデルの実験では、緊急時の単回急速投与ではなく、低用量を数週間にわたって毎日投与しました。最初の研究では、頸動脈を永久閉塞させたラットに、4 mg/kgを1か月間毎日投与しました。直後の課題成績ではなく記憶の固定を対象とするため、投与は毎日の訓練終了後に行いました。閉塞群の動物は、視覚弁別課題の学習が遅く、難しい記憶確認試験での成績も低下しました。一方、遊泳能力、運動活動、においの認識には影響がありませんでした。毎日の投与により、全般的な運動行動を変えることなく、学習と記憶の障害が軽減されました。

続く研究では、同じ1か月の投与スケジュールの後、44の脳領域で、ミトコンドリア複合体IVに相当するシトクロムオキシダーゼを測定しました。閉塞により、視覚皮質、前頭前皮質、嗅周皮質、海馬、扁桃体で酵素活性が低下し、視覚皮質と海馬の間の活動の連動も弱まりました。投与により各領域の酵素活性が維持され、領域間の代謝の相関が強まりました。また、活性が維持されていることは、より良い課題成績と相関していました。これらの相関は、代謝酵素活性の連動を表すものであり、ヒトの機能的結合を直接測定したものではありません。脳のエネルギー代謝に関するレビューは、この区別を理解するうえで役立ちます。

別の1週間の研究では、2 mg/kgを毎日投与し、機序を検証するためにシグナル伝達経路の阻害剤を加えました。投与により、脳血流は毎分100 g当たり約60から約100 mLへ増加し、海馬の血管密度は約15.1から23パーセントへ上昇しました。細胞生存に関わるPI3K/Akt経路を阻害すると、両方の増加が部分的に抑えられました。また、投与によってリン酸化Aktが増加しました。血流、血管密度、バリア、神経細胞に関する所見は、純粋な代謝作用ではなく、PI3K/Aktシグナル伝達に結び付いた神経血管保護を示唆しています。

これらの結果が脳卒中の救急治療に直結しない理由

これらの結果をそのまま臨床に適用できない理由は、実験条件が管理されていることにあります。培養細胞には血栓がなく、薬物動態も反映されません。2VOモデルは長期にわたる脳全体の低血流であり、発生から数分のペナンブラを伴う突然の局所的な塞栓ではありません。ラットのMCAOでも、若く健康な動物、麻酔、均一な閉塞、厳密なタイミングでの投与を用います。これは、血栓の性状がさまざまで、動脈硬化、高血圧、糖尿病を伴い、発症時刻も不明なことがある高齢患者とは異なります。

急性虚血性脳卒中の救急治療としてメチレンブルーを確立した、ヒトを対象とする公表済みのランダム化試験はありません。ときどき引用されるヒトの画像研究は、脳卒中患者ではなく、健康な成人26人を対象としたものです。単回の経口投与により、課題に関連する脳信号が変化し、記憶の想起にわずかな改善が認められました。これは中枢での作用を示すものであり、脳卒中への有効性を示すものではありません。現在の救急治療の指針は、適応のある患者への静脈内血栓溶解療法と、適応のある大血管閉塞に対する血栓回収術による迅速な再灌流を中心としています。標準的な脳卒中救急診療の経路が、引き続き唯一の実証された対応です。脳卒中が疑われる場合、メチレンブルーを投与するために救急対応を遅らせてはいけません。前臨床の投与量を外挿する際の実際上の限界からも、ラットの投与スケジュールを臨床の投与法として解釈できない理由がわかります。

安全性の面からも、この区別は明確です。静脈内メチレンブルーには、SSRI、SNRI、MAO阻害薬などのセロトニン作動薬との併用により、重篤または致死的なセロトニン症候群が生じることについて、枠付き警告があります。脳卒中が多い年齢層の患者の多くは、これらの薬剤を服用しています。溶血のリスクがあるため、G6PD欠損症では禁忌です。また、一酸化窒素のシグナル伝達を阻害し、状況によっては血管抵抗と血圧を上昇させます。そのため、単に脳血流を増やす薬剤と説明すべきではありません。後天性メトヘモグロビン血症に対して承認されている1 mg/kgの静脈内投与法は、脳卒中に対する投与法ではありません。

正確にまとめると、示された結果の範囲は限定的ですが、明確な知見はあります。一過性の局所虚血では、再灌流の前後に低用量のメチレンブルーを投与すると、ラットの病変の進行が抑えられました。永久閉塞では、梗塞を遅らせたものの、防ぐことはできませんでした。アストロサイトでは、厳しい欠乏状態の間には有害に働き、再酸素化時には有益に働きました。慢性低灌流では、数週間にわたってシトクロムオキシダーゼ、血管、記憶が維持されました。1つの電子運搬体でも、3つの状況では3つの異なる結果を示します。