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メチレンブルー、Nrf2、ミトコンドリア生合成：測定されたことと、まだ提案段階のこと
メチレンブルーについて書かれた文章では、次のような一文が頻繁に登場します：Nrf2を活性化し、新しいミトコンドリアを構築する。この文は1つの主張のように読めますが、実際には異なるシステムで研究され、異なる種類の証拠に基づく2つの異なる概念を含んでいます。1つ目はシグナル伝達経路であり、防御遺伝子をオンにするセンサーです。2つ目は構築プログラムであり、細胞がより多くのミトコンドリア機構を作る過程です。シグナルは構築を引き起こす可能性がありますが、シグナルが発生したことを示すことは建物が完成したことを示すものではなく、建築材料が増えたことを示すことは電力供給が改善したことを示すものでもありません。この記事では、この3つを分けて扱います。
Nrf2の概念：防御壁ではなくセンサー
Nrf2（nuclear factor erythroid 2-related factor 2）は転写因子であり、遺伝子をオンにする役割を持つタンパク質です。通常の状態では、Nrf2はKeap1というセンサータンパク質によって細胞質内に保持され、細胞の廃棄機構へ渡されて継続的に分解されます。酸化物質や求電子物質がKeap1上の反応性システインを修飾すると、廃棄が停止します。新しく作られたNrf2は蓄積し、核へ移動し、小型Mafタンパク質と結合して、抗酸化応答エレメントと呼ばれるDNA配列に結合します。この結合により、一連の防御遺伝子がオンになります。
この経路の標準的な指標は特定されています。NQO1（NAD(P)H quinone dehydrogenase 1）とTrxR1（thioredoxin reductase 1）は、最も信頼性の高いNrf2標的遺伝子の一部です。HO-1（heme oxygenase-1）は強く誘導されますが、他の制御因子にも応答します。SODやカタラーゼなどの酵素は抗酸化機構ですが、その量は多くの転写因子によって制御されるため、SODの増加だけではNrf2が原因だったことを証明できません。シグナル伝達イベントに最も近い証拠は、核内Nrf2の蓄積、AREレポーターの活性化、またはNrf2を除去すると消失する標準的標的遺伝子の誘導です。それ以外のすべて、つまり酸化物質レベルの低下、ストレス下での生存率向上、グルタチオン増加などは、多くの経路が生み出せる下流効果です。
この物語における最初期のメチレンブルーの結果は、その尺度の後半部分に当てはまります。ナノモル濃度のメチレンブルーに曝露された線維芽細胞では、メチレンブルーとミトコンドリア強化および老化遅延を初めて関連付けた研究で報告されたように、複合体IV量の増加、酸素消費量の増加、フェーズ2酵素TrxR1およびNQO1の誘導とともに、老化の遅延が示されました。TrxR1とNQO1は、注意深い読者が確認したい標準的なNrf2標的です。しかし、この研究ではシグナル伝達イベントそのものは示されませんでした。核内Nrf2測定、AREレポーター、Nrf2ノックアウト対照はありませんでした。したがって、慎重な解釈では、この系においてメチレンブルーが既知のNrf2標的遺伝子を誘導したことはNrf2活性化と一致しますが、原因としてNrf2だけを特定したわけではありません。標的遺伝子の誘導は、スイッチが入った後の1段階下流の現象です。
生合成の概念：3つのチェックポイントを持つプログラム
ミトコンドリア生合成とは、細胞がより多くのミトコンドリア能力を作るプログラムです。その教科書的な階層は3つのチェックポイントを経由します。第一に、コアクチベーターPGC-1alphaがプログラムを開始します。第二に、核転写因子（紛らわしいことに、そのうち1つはNRF1、nuclear respiratory factor 1という名前であり、Nrf2とは異なるタンパク質です）が、ミトコンドリアDNAを維持・複製するTFAMを含むミトコンドリア遺伝子の発現を促進します。第三に、細胞は最終的により多くのミトコンドリアゲノムと呼吸機構を持つようになり、mtDNAコピー数、クエン酸シンターゼ活性、または呼吸複合体の量と活性として測定できます。
各チェックポイントは、前のものより強い、または弱い主張になります。PGC-1alphaやTFAMメッセンジャーRNAの増加は、プログラムが要求されたことを示しますが、完了したことを示すものではありません。mtDNAや複合体IVタンパク質の増加は材料が増えたことを示しますが、再構築されたミトコンドリアも同じように見える可能性があります。より良い呼吸、より高い酸素消費量、または複合体活性は機能変化を示しますが、新しいミトコンドリアがなくても機能は改善する可能性があります。強い生合成の主張には、制御因子、内容量、機能の3つすべてが必要です。
線維芽細胞の追跡研究では、この連鎖の大部分が調査されました。100ナノモル濃度のメチレンブルーで処理したヒトIMR90細胞では、NADとNADHの比率が15分以内に一時的に上昇し、1日以内に基準値へ戻りました。この一時的なエネルギーシグナルに続いて、エネルギーセンサーAMPKの一時的なリン酸化、その後PGC-1alphaおよび、機能する複合体IVの組み立てに必要なタンパク質であるSURF1の誘導が起こりました。複合体IV活性はおよそ2倍になり、細胞内酸化物質は約28％低下し、テロメアの短縮はより遅くなりました。完全な連続過程は、メチレンブルーの酸化還元活性をAMPKとミトコンドリア生合成につなげた論文で説明されています。
この論文では、通常省略されるような2つの詳細が重要です。第一に、重要なのは単なる存在ではなくパターンでした。メチレンブルーはAMPKを一時的にオンにしましたが、対照薬AICARはAMPKを慢性的にオンにし、一時的活性化の方が老化遅延効果は約8倍高く示されました。したがって「メチレンブルーはAMPKを活性化する」という主張は不完全です。正確には、一時的にAMPKを活性化し、その比較から慢性的活性化では同じ作用をしないことが示唆されます。第二に、メチレンブルーは細胞周期を変化させませんでした。これは、細胞が単に分裂速度を落としたために若く見えたという最も単純な代替説明を除外します。
マウスでの分岐：行動、ゲノム、意図的に逆説的な引き金
細胞培養での研究は、中年マウスを研究するグループによって動物へ拡張されました。60日間経口メチレンブルーを投与した後、処理群のマウスは未処理の高齢マウスと比較して、身体的持久力と探索行動をより維持し、不安様行動が少なく示されました。脳組織では、加齢によって抑制されていたNRF1、TFAM、SOD2、複合体IVサブユニットCOX1の遺伝子が成体レベルに近い状態へ回復し、mtDNAコピー数も増加しました。これらの結果は、行動、制御因子、ゲノム量を含むものとして、メチレンブルーと脳ミトコンドリア生合成に関する中年マウス研究で報告されています。
提案されている引き金が興味深い部分です。なぜなら、メチレンブルーは抗酸化物質であるという単純な説明とは逆になるからです。処理されたマウスでは、脳ミトコンドリアにおける活性酸素種生成、特に過酸化水素が増加しました。著者らの提案は、軽度の過酸化物シグナルがNrf2経路を活性化し、それによって生合成プログラムを促進するというものです。このモデルでは、メチレンブルーは引き金の段階では酸化促進因子であり、結果の段階では抗酸化的に働きます。これは薬理学者がホルミシスと呼ぶパターンであり、小さなストレスがそれ自体より大きな防御反応を誘発する現象です。ただし、その過酸化物上昇が実際にNrf2活性化を引き起こすかは直接検証されていません。それは測定された結合ではなく、提案された橋渡しです。
同じグループによる関連研究では、この提案の安全性側面を検証しました。単離された脳ミトコンドリアでは、メチレンブルーは50ナノモルという低濃度でも過酸化水素生成を増加させましたが、治療濃度ではミトコンドリアDNAへの検出可能な損傷は生じませんでした。100マイクロモルという治療濃度を大きく超える濃度でのみ、特定のmtDNA断片に損傷が示されました。また、20マイクロモルの色素と赤色光の組み合わせでは、一重項酸素が生成され、広範なmtDNA損傷を引き起こしました。これは暗所での薬理作用ではなく、色素の既知の光増感剤としての挙動です。前処理は、ロテノン誘導性mtDNA病変から腹側中脳ミトコンドリアを保護しました。用量反応と遺伝毒性対照は、メチレンブルーの非遺伝毒性過酸化物生成に関する研究で詳述されています。
測定されたものと提案されたもの：図の読み方
以下の経路図は、本文で扱ってきた区別を明確にするため、この記事用に作成されました。実線の枠で示されたボックスは、メチレンブルー文献で直接実験的支持がある段階です：NAD/NADHを変化させる酸化還元サイクル、一時的AMPKリン酸化、PGC-1alphaおよびSURF1誘導、複合体IV活性上昇、NQO1およびTrxR1誘導、マウス脳における生合成遺伝子発現とmtDNAコピー数の回復、そして治療濃度でのmtDNA損傷を伴わない過酸化物上昇です。破線の枠は提案された結合を示します：Keap1による過酸化物シグナルの検知、Nrf2核内蓄積による防御遺伝子誘導、そしてNrf2活性化から生合成プログラムへの因果矢印です。これらの破線部分は妥当で、データと一致し、標準的な生物学の知識にも合いますが、これらの論文では実線の枠に昇格させるための対照（核内Nrf2、AREレポーター、Nrf2ノックアウト）を用いて測定されていません。
図を見ることで、3つの混同が明確になります。第一に、NRF1とNrf2は名前がほぼ同じですが異なるタンパク質です。マウス研究で測定されたのは生合成制御因子である核呼吸因子1であり、抗酸化転写因子ではありません。この2つを混同すると、図全体が1つのノードに縮約されます。第二に、遺伝子発現は物語の始まりであり終わりではありません。回復したTFAMやCOX1メッセージは生合成要求を支持しますが、mtDNAコピー数と複合体IV活性は、その要求が実行された証拠です。第三に、抗酸化結果はNrf2経路を証明するものではありません。線維芽細胞での28％の酸化物質低下やマウスでのロテノン保護は実際の下流効果ですが、複数の経路がこれらに収束します。