メチレンブルーはミトコンドリア複合体IIIをバイパスできるのか？研究結果が一致しない理由

2つの研究室が、メチレンブルーが阻害されたミトコンドリア複合体IIIをバイパスできるかを検証しました。一方は「できない」と結論し、もう一方は「部分的にできる」と結論しました。どちらもデータに基づいています。

最初の研究はマウス脳ミトコンドリアで、この色素はバイパスできないことを示しました。2番目の研究は3種類のげっ歯類の脳ミトコンドリアで、部分的に可能であることを示しました。3番目の研究はマウス肝臓を対象としており、近くで引用されることがありますが、別の内容を検証しています。その位置づけを正しく理解すれば、混乱の半分は解消されます。

発表できる単一の普遍的メカニズムはありません。3つの実験があり、それぞれ阻害剤、濃度、測定項目が異なります。まず条件を確認してください。結論はその後に続きます。

ここでいうバイパスとは

電子はNADHから複合体I、またはコハク酸から複合体IIを経由して電子伝達系に入り、複合体IIIを通過してシトクロムcへ、その後複合体IVを経て酸素へ渡されます。その過程で形成される勾配を細胞はATP産生に利用します。

バイパスの主張とは、メチレンブルーが遮断部位より上流から電子を受け取り、下流へ渡すことを意味します。酸化型色素はNADHまたは電子伝達系初期成分から電子を受け取り、ロイコメチレンブルーとなり、還元型はシトクロムcまたは電子伝達系へ電子を戻します。電子の受け渡し先が遮断部位より下流であれば、呼吸と膜電位は部分的に回復します。受け渡し先が遮断部位または上流であれば、回復は起こりません。

複合体IIIの1つの特徴が、この議論の大部分を左右します。複合体は2つの阻害部位を持つQサイクルで動作します。アンチマイシンはQi部位に結合します。ミクソチアゾールはQo部位に結合します。どちらか一方だけを使用した研究は、複合体の半分だけを検証したことになります。

研究1：マウス脳ミトコンドリアではバイパスなし

GureevらはC57BL/6マウスの大脳皮質ミトコンドリアを使用し、ジギトニンで単離し、0.1 mgタンパク質/mlで測定しました。基質は3つの条件で検証されました：ピルビン酸＋リンゴ酸を各5 mM、グルタミン酸2 mMを加えたコハク酸10 mM、L-プロリン10 mMです。阻害剤は複合体I阻害のロテノン1マイクロモル、複合体III阻害のアンチマイシン1マイクログラム/mlでした。色素濃度は0.5、1、2マイクロモルで、主な濃度は1マイクロモルでした。方法と測定結果はFEBS Letters communicationにあります。

複合体Iのバイパスは機能しました。ロテノンによりADP刺激呼吸は約121から約2 nmol/分/mgへ低下し、1マイクロモルの色素で約21まで回復しました。ピルビン酸＋リンゴ酸およびL-プロリン条件で膜電位も回復しました。

複合体IIIのバイパスは起こりませんでした。アンチマイシンにより呼吸は約16まで低下し、色素を加えても約20までしか変化しませんでした。色素濃度を最大5マイクロモルまで上げても、どの基質でも膜電位は回復しませんでした。過酸化物データも同じ方向を示しました：色素単独では過酸化物発光が基礎値約76 pmol/分/mgから、3つの濃度でそれぞれ約1170、1460、1945まで上昇しましたが、アンチマイシンはその色素依存シグナルをそれぞれ約25、88、96％低下させました。還元型色素が直接酸素と反応するなら、複合体IIIを遮断してもシグナルは抑制されないはずです。著者らは、還元型色素が複合体IIIのQo部位で酸化され、アンチマイシン遮断部位より上流にあると推定しました。短く言えば、電子供与体から色素へ、色素からQoへ、通常経路へ続く流れです。ロテノンはバイパスされます。アンチマイシンはされません。

研究2：3種で両方の阻害部位に対する部分的バイパス

Svabらは設計を拡張しました。マウス、ラット、モルモットの脳ミトコンドリアをPercollで単離し、同じ0.1 mg/ml条件で、ピルビン酸＋リンゴ酸またはグルタミン酸＋リンゴ酸を各5 mMで測定しました。複合体III阻害剤として、アンチマイシンA 0.3マイクロモルとミクソチアゾール1マイクロモルの2種類を使用しました。多くの測定では色素濃度は2マイクロモル、シトクロムc実験では0.5マイクロモルでした。3種すべてを同一プロトコルで扱った研究はopen access paperにあります。

両方の阻害条件で、3種すべてにおいて部分的バイパスが確認されました。マウスミトコンドリアでは、アンチマイシンにより呼吸が抑制され、色素により約60％上昇し、約37から59 nmol/分/mgになりました。ミクソチアゾールでは88％抑制され約4.5になりましたが、色素により5倍の約23まで上昇しました。膜電位はどちらの阻害剤条件でも部分的に再分極し、光学的アーティファクトを除外するため2種類の色素（サフラニンOと比率測定TMRM）で測定されました。

この研究では、最初の研究では行われなかった受け渡しそのものも直接検証しました。25マイクロモルの外因性アセチル化シトクロムcは、阻害剤の有無にかかわらずエネルギー化ミトコンドリアによって還元されませんでしたが、色素を加えると両条件で還元が進みました。無細胞バッファーでは、NADH＋色素によるシトクロムc還元速度はNADH量に比例しました。より大きな経路を言葉で表すと、還元当量から色素へ、色素から直接シトクロムcへ、複合体IVから酸素へという流れです。この経路は複合体IIIを完全に迂回するため、両方の阻害剤はバイパス可能です。

この解釈を支持する追加測定が2つあります。ミクソチアゾール処理ミトコンドリアに色素を加えるとNAD(P)H蛍光が低下し、還元当量が新しい経路を通って消費されたことを示しました。また、660 nmでの色素吸光度は各添加に対応して変化し、遠心後の上清ではエネルギー化ミトコンドリア内に酸化型色素が100倍以上濃縮された後、膜電位が崩壊すると外へ出ることが示されました。プロトン収支も一致します：ポンプ過程を飛ばすと、電子対あたり約10個ではなく約2個のプロトンになります。そのため、部分的な再分極だけを伴う酸素消費増加は、実際のバイパスで見られる特徴であり、反証ではありません。

同じ調製条件では、表面的な読み方を避ける必要がある反応も示されました。阻害剤＋色素ではADPが呼吸を上昇させるのではなく低下させ、輸送遮断は低下ではなく刺激しました。一方で膜電位は通常の方向に変化しました。この系では酸素消費だけを見ると誤解を招きます。

研究3：複合体IIIではなく複合体IとIIを検証した肝臓研究

LeeとBoelsterliはマウス肝臓ミトコンドリアと培養肝細胞を使用し、エファビレンツ（複合体I、IC50は約30マイクロモル）およびイソニアジド代謝物であるヒドラジン（複合体II、IC50は約30マイクロモル）による障害を調べました。約30マイクロモルの色素はNADH酸化、膜電位、ATPを回復させ、酸化物質と壊死性細胞死を低下させました。Redox Biology paperでは、色素が障害された複合体IおよびIIの周囲で電子を運ぶモデルとして説明されています。

この結果は上流側の文脈として確立しており、複合体IIIについては何も示していません。そこでは複合体IIIは遮断されていないため、どちらの脳研究も確認も反証もできません。

条件マトリックス

両方の複合体III研究が、それぞれの条件について正しい可能性がある4つの理由

1. 阻害条件が同じではなかった。 アンチマイシン単独1マイクログラム/mlと、アンチマイシン0.3マイクロモル＋別のQo部位阻害剤との違いです。Qo部位へ電子を供給する色素経路は、直接シトクロムcへ渡す経路が成功する場所では失敗します。1つの部位で両方を代表することはできません。

2. 色素濃度と測定タイミングが異なった。 1対2マイクロモルという主濃度の違いで、取り込みと直接シトクロムc還元が濃度および時間依存するレドックスサイクラーを使用しています。小さな濃度差と異なる測定時間が、1つのネットワーク内の異なる経路を明らかにする可能性があります。

3. 調製方法が異なった。 ジギトニン単離とPercoll密度勾配単離では、重複するものの同一ではないミトコンドリア集団が選択されます。タンパク質濃度は0.1 mg/mlで一致しているため、この変数は除外できますが、亜集団と完全性は残ります。また、種の違いという疑いは解消されました。2番目のグループはマウスでも同じ表現型を再現しました。

4. 基質状態が色素の作用を決める。 3種類の基質条件とNADH関連ペアの違いがあります。NADH供給と膜電位は共同で色素がどれだけ速く還元され、どこに分布するかを決定します。還元型色素と酸化型シトクロムcを必要とする経路は、その選択に依存します。

次のバイパス主張を読む方法

どの複合体が、どの阻害剤で、どの部位と濃度で遮断されたのかを確認してください。色素濃度と測定タイミングを確認してください。組織、種、単離方法、タンパク質濃度、基質も確認してください。そして、膜電位、呼吸、レドックス状態、直接受け渡し測定が一致しているかを確認してください。このケースでは酸素消費だけを見ると複数回誤った方向を示しました。

限定的な要約は維持されます。複合体I周辺での色素バイパスは合意されています。複合体III周辺では、アンチマイシン1マイクログラム/mlと色素1マイクロモルを用いたマウスミトコンドリアでは機能的バイパスは示されませんでした。一方、アンチマイシン0.3マイクロモ