EMB寒天培地とMacConkey寒天培地：培地の選択と判読

ある学生が、同じ水試料を2枚のプレートに画線塗抹します。一方には緑色の金属光沢を伴う暗色のコロニーが現れ、もう一方にはぼんやりしたハローを伴う鮮やかなピンク色のコロニーが現れます。どちらのプレートも同じチューブから接種され、並べて培養され、同じ時刻に判読されました。学生は、どちらのプレートが正しいのかと尋ねます。

どちらのプレートも正しいのです。それぞれ異なる問いに答えています。混乱は、この2種類の培地を腸内細菌を調べるための互換可能なスクリーニング法として扱うことから生じます。両者の目的は共通しており、グラム陰性腸内細菌を選択し、乳糖発酵菌と非発酵菌を区別することですが、その目的を実現する化学と視覚的な判読原理が異なります。この2つの基本概念を理解すれば、培地の選択とコロニーの判読は定型的な作業になります。

要点

EMB寒天培地では、エオシンYとメチレンブルーという2種類の色素が2つの役割を果たします。これらはグラム陽性菌の増殖を抑制すると同時に、酸を強く産生する菌の周囲で沈殿し、暗色のコロニーを形成します。典型的なEscherichia coliでは金属的な緑色光沢が見られます。MacConkey寒天培地では役割が分かれています。胆汁酸塩とクリスタルバイオレットがグラム陽性菌を抑制し、乳糖が発酵基質となり、ニュートラルレッドが酸の生成をピンク色または赤色のコロニーとして示します。E. coliを推定的に分かりやすく示すことが目的なら、EMBには明確な利点があります。特に便や尿のワークフローで、乳糖発酵菌と非発酵菌をピンク色と無色で明瞭に分類することが目的なら、通常はMacConkeyの方が判読しやすくなります。どちらのプレートも、色だけで菌種を同定するものではありません。

EMB：選択と指示を同時に担う色素

EMBの考え方では、選択と指示の機能が同じ分子に組み込まれています。ASMのエオシンメチレンブルー寒天培地プロトコルでは、EMBは選択培地かつ鑑別培地とされており、色素の組み合わせが多くのグラム陽性菌を抑制する一方、乳糖発酵によって色素の取り込みと沈殿が促進されます。標準的なLevine処方には、ペプトン、乳糖、リン酸塩、エオシンY、メチレンブルー、寒天が含まれます。FDA BAMのLevine EMB寒天培地法にも同様に記載されています。古いEMB処方には乳糖とともにショ糖を加えるものもありますが、Levine EMBには乳糖が含まれ、ショ糖は含まれません。そのため、使用している研究室でどの処方を採用しているか記録してください。

EMBの判読では、色素の挙動を読み取ります。活発な乳糖発酵では、強い色素沈殿を引き起こすのに十分な酸が産生され、E. coliでは中心部が濃い青黒色となり、典型例では反射光下で緑色の金属光沢が現れます。EnterobacterやKlebsiellaなど、発酵が比較的弱い菌では通常、そのような光沢を伴わないピンク色から紫色の粘液性コロニーとして増殖します。Salmonella、Shigella、Proteusなどの非発酵菌は、色素を沈殿させるほど急激な酸産生を起こさないため、通常は無色または半透明のコロニーとして増殖します。グラム陽性菌は通常抑制されますが、抑制の程度は菌株や製品によって異なります。メチレンブルーがそもそもカチオン性色素として挙動する理由を含む詳細な色素調製化学については、色素処方を扱う別の議論に譲ります。一般的な顕微鏡観察の文脈については、染色法アトラスを参照してください。この記事では、プレートの選択と判読に焦点を絞ります。

上の図は説明用です。EMBでは暗色で光沢のあるコロニー、ピンク色の粘液性コロニー、淡色のコロニーが見られ、MacConkeyではピンク色と淡色のコロニーに分かれる、という視覚的な判読原理を示しています。この図でパターンを学んだ後、実際の判定では、写真付きの対照と、使用している正確な培地製品の添付文書を確認してください。

MacConkey：役割を分離した、より単純な視覚ルール

MacConkeyの考え方では、それぞれの役割を別々の成分に割り当てます。ASMのMacConkey寒天培地プロトコルでも同じく選択培地かつ鑑別培地として説明されており、FDA BAMのMacConkey寒天培地法には、ペプトン、乳糖、胆汁酸塩、塩、ニュートラルレッド、クリスタルバイオレット、寒天という主要成分が記載されています。胆汁酸塩とクリスタルバイオレットによってグラム陽性菌が抑制されます。乳糖は発酵基質を供給します。ニュートラルレッドはpH指示薬として働き、酸が生成された部分をピンク色から赤色に変化させます。強い発酵菌では、その周囲に胆汁の沈殿が見られることもあります。

判読ルールは意図的に単純です。ピンク色なら乳糖発酵菌、無色または淡色なら非発酵菌です。E. coliはピンク色から赤色を呈し、多くの場合、胆汁沈殿によるハローを伴います。KlebsiellaとEnterobacterはピンク色となり、莢膜のため粘液性になることがよくあります。Salmonella、Shigella、Proteus、およびその他多くのグラム陰性桿菌は無色になります。教育実習では別の利点もあります。胆汁酸塩は一般にProteusのスウォーミングを抑えるため、非選択培地よりもMacConkeyの方が単離コロニーを得やすくなります。ただし、抑制は完全ではなく、スウォーミング制御を優先する場合には無塩の代替培地もあります。

色素がこのように挙動する分子的な理由は、電荷と構造に由来します。メチレンブルーはカチオン性のフェノチアジン色素であり、その構造と性質から、酸性の細菌表面に親和性を持つ理由が説明できます。この親和性は、EMB上の酸性領域でメチレンブルーが沈殿するときにも作用しています。

比較一覧

この表は判断手順として読んでください。実習で、発酵強度の段階差と、その先にある劇的な反応を学生に見せる必要があるなら、EMBが適しています。生化学的確認の前段階として迅速な二分分類が必要なら、MacConkeyが適しています。

試料別の培地選択

推定的な糞便系大腸菌群またはE. coliの認識を目的とした水試料の実習では、光沢が視覚的に特徴的であるため、EMBは有用です。MacConkeyも腸内系のグラム陰性菌に対応でき、水質検査で使用されてきた歴史もありますが、どちらのプレートも規制上定められた水質試験法の代替にはなりません。試験によっては、modified mTECやMIなどの培地が指定されることがあります。研究室で従う必要のある方法を確認してください。

便試料を想定して発酵菌と非発酵菌を分離する場合、一般にMacConkeyの方がこの2種類の中では有用です。SalmonellaやShigellaを対象とする実際の便検査では、通常、MacConkeyだけに依存するのではなく、XLDやHektoen entericなど、より選択性の高い腸内細菌用培地も併用します。

臨床ワークフローを模した尿試料の教育実習では、MacConkeyと血液寒天培地を組み合わせます。MacConkeyはグラム陰性菌の初期分類を行い、血液寒天培地はMacConkeyで抑制される微生物を回収します。この組み合わせは、尿培養のセットアップを説明する臨床資料で標準的に見られます。

概念そのものを教えるなら、両方を使用します。EMBでは、発酵の強さが重要であることと、1つの分子が2つの役割を担えることを学べます。MacConkeyでは、選択成分、基質、指示成分を分離したモジュール型設計を学べます。既知のE. coli、既知のKlebsiella aerogenes、既知のSalmonellaを両方の培地に並べて画線塗抹した学生は、その後この2つの原理を混同しにくくなります。

毎回繰り返される判読上の落とし穴

最も一般的な失敗は、色だけで同定することです。MacConkey上のピンク色コロニーは、E. coli、Klebsiella、Enterobacter、または別の発酵菌である可能性があります。無色のコロニーは、Salmonella、Shigella、Proteus、Pseudomonas、または別の非発酵菌である可能性があります。色は、グラム染色、オキシダーゼ試験、生化学パネル、機器による同定などの確認作業へ導くスクリーニング表現型であり、菌種名そのものではありません。

2つ目の失敗は、光沢がないことを過剰に解釈することです。実際のE. coliコロニーでも、特に単離されたコロニーでは、EMB上で金属光沢がほとんど、またはまったく見られない場合があります。光沢がないからといってE. coliを除外できず、光沢があるからといってE. coliであると証明できるわけでもありません。光沢は推定的な手掛かりとして扱ってください。

3つ目の失敗は、培養時間の異なるプレートを比較することです。遅延型の乳糖発酵菌は、長時間培養するとMacConkey上でピンク色になることがあり、発酵菌と非発酵菌の明瞭な区別が曖昧になります。研究室で指定された時刻に判読し、結果とともに培養時間を記録してください。

4つ目の失敗は、混合増殖を1種類の菌として読むことです。ピンク色のコロニーの隣に無色のコロニーがある場合、それは中間的な1つの表現型ではなく、2つの表現型を示しています。十分に単離されたコロニーを釣菌し、それぞれの形態型を別々に扱ってください。粘液性という質感にも同様の落とし穴があります。KlebsiellaとEnterobacterはいずれも粘液性に見えることがあるため、莢膜だけで菌名を確定することはできません。かつてEnterobacter aerogenesとして教えられていた菌は現在Klebsiella aerogenesに分類されており、古い表と新しいラベルが一致しないように見える理由はここにあります。

対照と最後の原則

各セッションで、写真付きまたは新鮮な対照を使用してください。強い発酵反応の対照にはE. coli、典型的な光沢を伴わない粘液性発酵の対照にはKlebsiella aerogenes、無色の非発酵反応の対照にはSalmonellaの菌株、使用している製品でグラム陽性菌の抑制を確認する対照にはStaphylococcus aureusを使用します。選択性は胆汁、クリスタルバイオレット、色素の含有量によって変化するため、菌株番号と合格基準はメーカーの添付文書に合わせてください。

ベンチでは、1つの原則を覚えておいてください。EMBは、選択と指示の両方を担う色素を使用するため、判読がやや繊細になる代わりに、E. coliで劇的なシグナルを得られます。MacConkeyは選択と指示を分離しているため、発酵の細かな違いが見えにくくなる代わりに、ピンク色と淡色という単純な分類ができます。問いに合った原理を持つ培地を選び、色による判定を適切な試験で確認すれば、この2種類のプレートは競合するものではなく、互いを補完するものになります。