Nýtt metýlenblátt og netfrumulitun: sérstakt litarefni og aðferð fyrir lifandi frumur

Nemandi undirbýr netfrumutalningu, pantar metýlenblátt, blandar því við blóð og sér nánast ekkert. Samnemandi notar flösku merkta nýju metýlenbláu og fær skýra bláa þræði inni í hluta rauðkornanna. Fyrri nemandinn gerir ráð fyrir að innihald seinni flöskunnar sé ferskara eða þéttara. Hvorugt er rétt. Hún inniheldur aðra sameind.

Þessi hugtakavilla liggur að baki flestum misskilningi á þessu sviði. Nafnið gefur til kynna að nýtt metýlenblátt sé endurbætt framleiðslulota af metýlenbláu. Efnafræðin segir annað. Nýtt metýlenblátt N er sérstakt fenóþíasínlitarefni með eigið Colour Index-númer, sitt eigið mynstur skiptihópa og eigið staðlað hlutverk í blóðfræði. Þegar sá greinarmunur er skýr verður restin af aðferðinni auðskilin: hvers vegna frumurnar verða að vera lifandi þegar þær eru litaðar, hvað telst netfruma, hvar Heinz-korn koma við sögu og hvenær skærkresýlblátt kemur til álita.

Stutta svarið

Nýtt metýlenblátt N, hvarfefnið sem notað er í blóðfræði, er yfirleitt auðkennt sem Basic Blue 24 í PubChem-færslunni fyrir nýtt metýlenblátt, C.I. 52030, CAS 1934-16-3, með formúluna C18H22ClN3S. Venjulegt metýlenblátt er metýlþíóníníumklóríð, Basic Blue 9, í PubChem-færslu þess, C.I. 52015, CAS 61-73-4, með formúluna C16H18ClN3S. Í byggingu nýs metýlenblás eru tveir metýlhópar á hringnum og etýlamínóhliðarkeðjur þar sem metýlenblátt hefur dímetýlamínóhópa. Þessi munur breytir litunareiginleikunum. Blóðfræðirit lýsa venjulegu metýlenbláu sem fremur lélegu litarefni fyrir netfrumur og nýju metýlenbláu sem efni sem gefur dýpri og jafnari litun. Þessi samanburður er tekinn saman í umfjöllun ScienceDirect um nýtt metýlenblátt.

Já, nýtt metýlenblátt er supravítalt litarefni. Supravítal litun felur í sér að lita lifandi frumur eftir að þær hafa verið teknar úr líkamanum og áður en þær eru festar, samkvæmt skilgreiningu í yfirliti NCBI um meginreglur supravítalrar litunar. Bæði nýtt metýlenblátt og skærkresýlblátt tilheyra þessum flokki og netfrumustaðall CLSI fjallar sérstaklega um nýtt metýlenblátt sem supravítalt litarefni. Nemendur flokka þetta stundum með Romanowsky-litun á festum blóðstrokum. Sú hugmynd gengur ekki hér. Sé sýnið fest fyrst hættir aðferðin að virka.

Fyrir lesendur sem vilja átta sig á skyldum litarefnaheitum fjallar metýlblátt borið saman við metýlenblátt um annan og víðtækari rugling milli anjónísks tríarýlmetanlitarefnis og katjónískra fenóþíasínlitarefna. Yfirlitið um litun á rannsóknarstofu setur supravítala litun í samhengi við aðferðir fyrir fest blóðstrok og leiðarvísirinn um formgerð blóðfrumna sýnir hvar mat á netfrumum fellur inn í víðara samhengi deilitalningar.

Eitt varúðaratriði varðandi vöruskrár: sérstakt tvísaltform nýs metýlenblás með sinkklóríði er til undir CAS 6586-05-6. Í aðferðakafla ætti því að tilgreina saltformið og birginn, ekki aðeins almenna heitið.

Hvað supravítal litun gerir í raun

Netfruma er ungt rauðkorn sem hefur misst kjarnann en geymir enn leifar af ríbósóma-RNA. Í ólituðu votpreparati er þetta RNA ósýnilegt. Supravítalt litarefni berst inn í lifandi frumuna og fellir þetta RNA út eða safnar því í blá korn og þræði, net- og þráðlaga efnið sem sést við smásjárskoðun með olíudýfingu. Netið er því afurð litunarinnar, ekki fyrirfram mynduð grind sem bíður eftir lit. Þess vegna skipta breytur í verklaginu — styrkur litarefnis, stuðpúði, hlutfall blóðs og litarefnis, hitastig og tími — jafn miklu máli og heiti litarefnisins.

Í framkvæmd þýðir þetta að fylgja þarf strangri röð aðgerða: blandið fyrst blóði með storkuvara við litarefnið, látið standa, útbúið síðan blóðstrok og skoðið þau ófest og án mótlitunar. Festing fyrir litun eða mótlitun sem hylur daufa þræði eyðileggur upplýsingarnar sem talningin byggist á.

Verklag við netfrumutalningu með nýju metýlenbláu

Engin ein algild samsetning er til, svo tilgreinið þá sem er notuð. Þrjú skráð afbrigði sýna breiddina.

Hefðbundin aðferð af Brecher-gerð notar um það bil 0.5 prósent nýtt metýlenblátt með kalíumoxalati, blandað í jöfnum rúmmálum við vel blandað EDTA-blóð og látið standa í um 10 til 15 mínútur við stofuhita. Eftir varlega endurblöndun eru útbúin þunn, fleyglaga blóðstrok, þau loftþurrkuð og skoðuð ófest með 100x olíulinsu. Verklýsing NCBI fyrir netfrumutalningu lýsir þessu vinnuferli og talningarrammanum sem er notaður við það.

Afbrigði Dacie og Lewis notar 1.0 prósent nýtt metýlenblátt í sítrat-saltlausn, blandað við 2 til 4 rúmmál af blóði og haldið við 37 C í 15 til 20 mínútur áður en blóðstrok eru gerð. Í nýlegri útfærslu til samræmingar á CLSI H44-aðferðinni var notuð þynnri, 0.1 prósent lausn í fosfatstuðpaðri saltlausn við pH 7.4, með 10 mínútna biðtíma við 20 C og án festingar, eins og greint er frá í rannsókninni frá 2026 um samræmingu NMB-aðferða.

Talningarreglurnar eru sameiginlegar fyrir afbrigðin. Teljið frumu sem netfrumu ef hún inniheldur að minnsta kosti tvö aðskilin blálituð korn eða þráðbúta; þannig er stök litarefnisútfelling útilokuð. Teljið að minnsta kosti 1,000 rauðkorn í hefðbundinni vinnu og gefið netfrumur upp sem prósentuhlutfall. Við lág hlutföll krefst tölfræðin fleiri frumna. Í yfirliti um CLSI H44-aðferðafræðina kemur fram að við netfrumuhlutfall nálægt 1 prósenti þurfi um 4,400 frumur til að ná breytileika talningar niður í 5 prósent, samkvæmt yfirliti De Gruyter um CLSI H44. Miller-talningarskífa í augngleri gerir umfangsmiklar talningar framkvæmanlegar. Síið litarefnið eða útbúið ferska lausn, því útfellingar líkjast kornóttum innlyksum.

Heinz-korn í sama sýni

Sama supravítala blóðstrok getur einnig sýnt Heinz-korn, sem eru kekkir af oxuðu og eðlissviptu hemóglóbíni en ekki leifar af RNA. Í sýnum lituðum með nýju metýlenbláu birtast þau sem kringlótt korn, oft stök og nálægt frumuhimnunni, með ljósari bláum lit en net- og þráðlaga efnið. Þau varðveitast illa við festingu og mótlitun, svo skoðið ófesta strokið. Í nýlegu verklagi voru notaðir 20 míkrólítrar af EDTA-blóði með 20 míkrólítrum af 1 prósent nýju metýlenbláu og 15 mínútna biðtími. Frumur með Heinz-kornum voru taldar meðal 250 rauðkorna, eins og greint er frá í rannsókninni á PMC sem lýsir þessu verklagi.

Tvö atriði koma í veg fyrir rangtúlkun. Í fyrsta lagi lita metýlfjólublátt og kristalfjólublátt Heinz-korn sterkar en nýtt metýlenblátt, eins og fram kemur í umfjöllun ScienceDirect um Heinz-korn. Nýtt metýlenblátt er hentugur kostur þegar netfrumur og Heinz-korn eru metin saman, en ekki sterkasta litarefnið sem ætlað er sérstaklega fyrir Heinz-korn. Í öðru lagi mynda HbH-innlyksur hjá arfberum alfa-þalassemíu marga fíngerða punkta um alla frumuna eftir supravítala litun, en hefðbundin Heinz-korn eru færri, stærri og oft tengd frumuhimnunni. Litarefnisútfellingar eru þriðja fyrirbærið sem getur líkst þeim: þær liggja utan fókusplans frumanna og eru mismunandi eftir sjónsviðum.

Skærkresýlblátt borið saman við nýtt metýlenblátt

Bæði litarefnin eru supravítal litarefni fyrir netfrumur, en stöðlun styður annað þeirra fremur en hitt. CLSI H44-A2-aðferðin fyrir netfrumur, sem var þróuð í samstarfi við Alþjóðaráðið um stöðlun í blóðfræði og er skráð á síðu CLSI um H44-staðalinn, skilgreinir litun EDTA-blóðs með nýju metýlenbláu sem handvirku samanburðaraðferðina. Hefðbundin kennsla í blóðfræði er sammála um útlitið: nýtt metýlenblátt gefur dýpri og jafnari litun þráða, en skærkresýlblátt er breytilegra milli framleiðslulota og sýna.

Þessi staða þarfnast þó fyrirvara. Leiðbeiningar ICSH um mat á greiningartækjum samþykkja handvirka smásjárskoðun með nýju metýlenbláu sem viðmiðun við samanburð, en lýsa henni sem huglægri og tiltölulega ónákvæmri. Viðmiðunaraðferðir með flæðifrumugreiningu eru teknar fram yfir hana þar sem þær eru tiltækar. Í samanburði á 100 sýnum árið 2022 fannst minni kerfisbundið frávik frá niðurstöðum greiningartækisins með skærkresýlbláu en með nýju metýlenbláu, samkvæmt samanburði á litunaraðferðum á PMC. Traust samantekt fyrir nemendur er þessi: notið nýtt metýlenblátt sem staðlaða handvirka viðmiðunaraðferð, sannreynið hverja staðbundna aðferð með skærkresýlbláu gagnvart henni eða sjálfvirkri greiningu og búist við meiri dreifingu niðurstaðna við handvirka smásjárskoðun í báðum tilvikum. Eldri rit um stöðlun mæltu einnig með hreinsuðu Azure B sem efnafræðilega hreinni valkosti vegna breytileika milli framleiðslulota litarefna á markaði, samkvæmt rannsókn Marshalls á Azure B. Það skýrir hvers vegna hreinleikaflokkur hvarfefna kemur enn við sögu í umræðu um aðferðir.

Að forðast algengu mistökin

Fjögur mistök skýra flest misheppnuð sýni. Að panta venjulegt metýlenblátt í stað nýs metýlenblás N leiðir til veikrar litunar vegna efnafræðinnar, ekki vinnubrögðanna. Festing eða mótlitun fyrir skoðun fjarlægir supravítala merkið. Að telja litarefnisútfellingar sem korn hækkar niðurstöðuna, en tveggja korna reglan og síað litarefni koma í veg fyrir það. Að telja of fáar frumur þegar netfrumuhlutfallið er lágt gefur tölu sem virðist nákvæm en hefur víð öryggismörk. Öll þessi mistök hafa sama einkenni: sá sem skoðar sýnið í smásjá kennir smásjánni um það sem þegar hafði ráðist í hvarfefnisskrefinu.