Metýlenblátt og sjálfsát: AMPK, mTOR og tilraunir með taugafrumur

Ímyndaðu þér að þú gerir tilraun með frumur, bætir metýlenbláu við og sérð próteinband sem kallast LC3-II dökkna á próteinþrykki. Það er freistandi að lýsa því yfir að efnið „auki sjálfsát“ og láta þar við sitja. Sú túlkun er ótímabær. Dekkra LC3-II-band getur þýtt að fruman myndi fleiri bólur til að hreinsa til, eða að bólurnar safnist upp vegna þess að förgunarskrefið sé stíflað. Þessar tvær túlkanir vísa í gagnstæðar áttir og rannsóknir á metýlenbláu í taugafrumum innihalda dæmi um gögn sem styðja hvora túlkun um sig. Þessi grein fer yfir hvað var í raun mælt, mæliaðferð fyrir mæliaðferð.

Stórsjálfsát, sú gerð sjálfsáts sem hér er rannsökuð, er leið frumunnar til að endurvinna efni í stórum stíl. Himnusekkur sem kallast fagófóra vex utan um úr sér gengin prótein og frumulíffæri, lokast og myndar sjálfsátsbólu, sameinast leysikorni og innihaldið er brotið niður og losað til endurnýtingar. Taugafrumur eru háðar þessu ferli vegna þess að þær skipta sér ekki og geta ekki þynnt út skemmda frumuhluta með skiptingu. Þegar endurvinnslan stöðvast safnast úrgangur upp. Þegar hún gengur endurheimtir fruman byggingarefni við álag.

Hvað ein tilraun með frumur úr dreka sýndi

Í lykilrannsókninni á örvun sjálfsáts voru notaðar HT22-frumur úr dreka músa sem urðu fyrir álagi vegna sermissvelti í 24 klukkustundir. Við þær aðstæður eru vaxtarþættir og næringar- og viðhaldsboð fjarlægð, sem kveikir bæði á stýrðum frumudauða og sjálfsáti. Rannsakendurnir greindu frá því að metýlenblátt drægi úr frumudauða með styrkháðum hætti og að þessari vernd fylgdu merki um stórsjálfsát.

Breytingarnar á merkjunum voru skýrar. Dreifð LC3B-litun færðist yfir í punkta umhverfis kjarnann frá um 20 nM metýlenbláu, en sterkasta svörun LC3-I og LC3-II kom fram nálægt 1 μM. Bæði LC3B-I og LC3B-II jukust með styrk og tíma. Mikilvægt er að rannsóknarhópurinn gekk skrefi lengra en að skoða kyrrstæða LC3-mælingu á próteinþrykki. Hann bætti við 10 μM klórókíni, sem hindrar hreinsun í leysikornum, og fann aukið LC3-II ásamt stöðugra p62 í frumum sem höfðu fengið metýlenblátt. Þetta mynstur styður leysikornaháða umsetningu fremur en einfalda uppsöfnun. Rannsakendurnir sýndu einnig að klórókín dró að hluta úr hömlun stýrðs frumudauða, sem tengir verndina við sjálfsáts- og leysikornaferlið í þessu líkani.

Niðurstaðan um boðleiðir er sá hluti sem oftast er rangt farið með. AMPK-boð, metin með mælingum á fosfóruðu AMPK og fosfóruðu ACC, sem er markprótein þess neðar í boðleiðinni, jukust eftir 12 og 24 klukkustundir með styrkháðum hætti. AMPK-hemillinn Compound C, sem var notaður við 20 μM síðustu 4 klukkustundirnar, dró bæði úr fosfórun ACC og virkjun LC3. Aftur á móti kom engin mælanleg bæling fram á fosfóruðu mTOR. Í frumum úr dreka sem urðu fyrir álagi var niðurstaðan því AMPK-tengd örvun eftir leið sem virtist óháð mTOR. Sama mynstur kom fram í lifandi músum, þar sem meðferð með metýlenbláu örvaði merki um stórsjálfsát í heilaberki og dreka.

Örvun er ekki fullgilt flæði

Hér skiptir aðgreining hugtakanna mestu máli. Örvun þýðir að búnaðurinn í upphafi ferlisins myndar fleiri sjálfsátsbólur. Flæði þýðir að innihaldið fer alla leiðina: afmörkun, þroskun, samruna við leysikorn, niðurbrot og endurvinnslu. Sérhver aukning LC3-II telst fullyrðing um örvun þar til flæðipróf staðfestir að restin af ferlinu eigi sér stað.

Hefðbundið flæðipróf mælir LC3-II með og án stuttrar hindrunar á virkni leysikorna, til dæmis með bafílómýsíni A1 eða klórókíni. Ef meðferðin flýtir raunverulega fyrir myndun ætti hindrun niðurbrots að auka LC3-II enn frekar. Tvöfaldur mCherry-GFP-LC3-boðvísir gefur annað sjónarhorn: byggingarnar lýsa gult fyrir samruna við leysikorn en aðeins rautt eftir að sýra slekkur á GFP-merkinu. Fleiri punktar sem eru eingöngu rauðir styðja því framvindu yfir í súr sjálfsátsleysikorn. Minnkandi magn p62-próteins getur staðfest umsetningu innihalds, með þeim fyrirvara að umritun p62 bregst sjálf við álagi og ætti að athuga á mRNA-stigi.

Gátlistinn hér að neðan tengir hverja mæliaðferð sem notuð er í þessum rannsóknum við það sem hún mælir og það sem hún getur ekki sannað ein og sér. Lesendur geta notað hann við mat á öllum framtíðarfullyrðingum um stórsjálfsát, þar á meðal röksemdum um föstu og langlífi sem styðjast við þessi merki.

Taktu eftir einni gildru í orðalagi sem taflan ver gegn. Fosfórað ACC er það form ensímsins sem hefur verið hamlað. Aukning þess sýnir boð frá AMPK, ekki virkjun ACC.

Orðalagið „hömlun stórsjálfsáts afnam taugavernd“ krefst sömu nákvæmni. Í HT22-líkaninu þýðir það að truflun á sjálfsáts- og leysikornaferlinu fjarlægði þann ávinning fyrir lifun sem metýlenblátt veitti við sermissvelti. Það styður að sjálfsát sé nauðsynlegt eða eigi þátt í verndinni í þeirri frumurækt. Það staðfestir ekki að sjálfsát sé eina verndandi verkun efnisins, sannar ekki að klórókín verki eingöngu í gegnum sjálfsát og erfðafræðileg röskun á ATG5, ATG7 eða ULK1 væri nauðsynleg til að styrkja fullyrðinguna um orsakasamband.

Tvær leiðir inn í sama kerfi

Einfaldað yfirlit hjálpar. Orkuálag eykur virkni AMPK, AMPK virkjar ULK1-flókann og sjálfsát hefst. Vaxtarþættir og næringarefni auka virkni mTORC1, mTORC1 hamlar ULK1 og sjálfsát helst óvirkt. Neðar í ferlinu en ULK1 kemur Beclin-1- og VPS34-flókinn af stað myndun fagófórunnar, LC3-I fær lípíð tengt við sig og verður að LC3-II, sjálfsátsbólan lokast og sameinast leysikorni og innihaldið er brotið niður samhliða umsetningu p62.

Myndin staðsetur hverja niðurstöðu um metýlenblátt á þessu yfirliti: niðurstöðuna úr dreka við AMPK-greinina og niðurstöðuna úr forverafrumum við mTOR-greinina.

Þessi framsetning leysir úr því sem virðist stangast á við síðari rannsókn Xie. Í taugaforverafrumum úr rottum sem voru að fjölga sér leiddi önnur tilraun í ljós að 5 μM metýlenblátt hamlaði frumufjölgun og stuðlaði að hvíldarástandi. Ki67-jákvæðum frumum fækkaði á dögum 1 og 3, en sérhæfing frumna sem höfðu þegar stefnt í átt að taugafrumum hélst óskert. Þar lá verkunin í gegnum bælingu mTOR-boða: minnkað heildarmagn mTOR og fosfóraðs mTOR ásamt minni tjáningu p70S6K og 4EBP1, auk niðurstýringar á sýklínum E1, B1, D1 og D2. Ríkjandi svipgerð var hvíldarástand forverafrumnanna, sem höfundarnir tengdu við seinkaða frumuöldrun, ekki björgun frumna úr dreka sem urðu fyrir álagi.

Engin mótsögn er á milli greinanna tveggja. AMPK og mTOR samþætta boð eftir aðstæðum; þau eru ekki fastir rofar. Fruma sem líkist taugafrumu og verður fyrir álagi getur virkjað AMPK án mælanlegrar hömlunar mTOR, en forverafruma sem er knúin áfram af frumuskiptingarhvötum getur brugðist við sama efni með því að hægja á mTOR-háðum vaxtarbúnaði. Frumugerð, álagsaðstæður, styrkur og tímapunktur ráða því hvaða grein er ríkjandi. Þess vegna eiga áhrif metýlenblás á orkubúskap hvatbera og oxunar-afoxunarferli einnig heima í sömu mynd: eins og lýst er í yfirlitsgrein um verkunarhætti taugaverndar virkar efnið sem annar rafeindaberi, virkjar andoxunarboð og boð sem hamla stýrðum frumudauða, hamlar MAO og NOS og tengist endurnýjun hvatbera með nýmyndun og sjálfsáti. Sjálfsát er ein grein í fjölþættri verkun, ekki öll sagan.

Hvað tilraunirnar sýna ekki

Sermissvelti líkir eftir álagi vegna skorts á viðhaldsboðum og efnaskiptaálagi í frumurækt. Það líkir ekki eftir föstu heillar lífveru: glúkósi, amínósýrur og sölt eru enn til staðar í grunnræktunarætinu og engin fæðuhegðun á sér stað. Ekki er hægt að umbreyta styrk í rækt frá 20 nM til 5 μM í skammta fyrir fólk með einföldum útreikningi, því frásog, próteinbinding, oxunar-afoxunarástand, efnaskipti, uppsöfnun í vefjum og útsetningartími eru öll ólík.

Engin rannsókn á fólki hefur verið hönnuð til að sýna sjálfsátsflæði sem metýlenblátt örvar í sjúklingum. Gögnin um verkunarhætti koma enn úr frumurannsóknum, rannsóknum utan líkamans og dýratilraunum, og yfirlitsgreinar lýsa enn gögnum um yfirfærslu niðurstaðna til manna sem bráðabirgðagögnum. Þessar rannsóknir sýna því ekki að metýlenblátt líki eftir föstu, lengi líf fólks með sjálfsáti eða leiði sjálfsátsflæði alla leið í heila manna. Fullyrðingar um eftirlíkingu föstu og langlífi þurfa eigin klínísk gögn og rannsóknir á metýlenbláu hjá fólki vegna annarra ábendinga verða ekki að sjálfsátsrannsóknum við það eitt að tengja þær saman. Rannsóknir á næringarskortsálagi og langlífislíkönum ætti að lesa með þessi mörk í huga.

Þegar þú lest næstu grein skaltu fara í gegnum gátlistann í réttri röð. Spurðu fyrst hvaða grein breyttist: AMPK, mTOR eða hvorug. Spurðu síðan hvort LC3-niðurstöðunni hafi fylgt flæðipróf eða hvort hún standi ein og sér. Athugaðu svo hvort hindrun boðleiðarinnar hafi afnumið ávinninginn og með hvaða aðferð. Rannsókn sem svarar öllum þremur spurningunum hefur lagt grunn að sterkri fullyrðingu um verkunarhátt. Sú sem svarar aðeins þeirri fyrstu hefur sýnt boð sem heimila ferlið, en það sem eftir er af leiðinni er enn ókortlagt.