Grein
Metýlenblátt og köfnunarefnismónoxíð: NOS, cGMP og boðmiðlun í æðum
Spurningin hljómar einföld: hamlar metýlenblátt köfnunarefnismónoxíði? Á rannsóknarstofunni skiptist svarið í fjórar aðskildar spurningar og hver þeirra krefst annarrar tilraunaprófunar. Ruglingur á þeim er helsta ástæðan fyrir því að skrif um metýlenblátt og köfnunarefnismónoxíð virðast örugg en óljós.
Hugsum okkur boðmiðlun köfnunarefnismónoxíðs sem keðju með fjórum hlekkjum. Gen er umritað til að mynda köfnunarefnismónoxíðsyntasa. Ensímið umbreytir arginíni í köfnunarefnismónoxíð. Gasið flæðir að marki sínu áður en það hvarfast við eitthvað annað. Leysanlegur gúanýlatsýklasi nemur það og myndar hringlaga GMP. Birtar rannsóknir sýna áhrif metýlenblás á alla hlekkina, en gögnin koma úr ólíkum rannsóknarkerfum, við mismunandi styrk og með mismunandi ísóformum. Niðurstaða um einn hlekk sannar ekki verkun á öðrum.
Hefðbundna keðjan, útskýrð á einföldu máli
Í æðavegg er hefðbundin atburðarás þessi. Áreiti verkar á æðaþelsfrumu. Köfnunarefnismónoxíðsyntasi æðaþels, kallaður eNOS eða NOS3, myndar lítinn púls af köfnunarefnismónoxíði. Gasið flæðir inn í aðliggjandi slétta vöðvafrumu, binst hemhópi leysanlegs gúanýlatsýklasa með járni á afoxuðu formi og hraðar umbreytingu GTP í hringlaga GMP. Hringlaga GMP virkjar próteinkínasa G, stjórnun kalsíums breytist og vöðvinn slaknar.
Önnur keðja er þess virði að halda aðskildri. Við sýkingu eða útsetningu fyrir cýtókínum umrita frumur gen fyrir annað ensím, örvanlegan köfnunarefnismónoxíðsyntasa eða iNOS, einnig kallaðan NOS2. Það myndar meira og langvinnara flæði köfnunarefnismónoxíðs en eNOS. Þriðja ísóformið, NOS í taugafrumum eða nNOS, tilheyrir enn öðru samhengi. Þegar grein nefnir köfnunarefnismónoxíðsyntasa án þess að tilgreina ísóformið skaltu staldra við og athuga hvert þeirra var mælt. Yfirlitið um hvernig metýlenblátt flytur rafeindir undirstrikar sama atriði fyrir oxunar-afoxunarmörk almennt: milliliðurinn gerir ekkert einn og sér og samstarfsaðilinn á hvorum enda ræður niðurstöðunni.
Mælt hringlaga GMP er líka samþættur mælikvarði, ekki bein ensímmæling. Magn þess endurspeglar nýmyndun fyrir tilstilli sýklasa að frádregnu niðurbroti af völdum fosfódíesterasa, einkum PDE5 í sléttum vöðvum æða. Lækkun á hringlaga GMP merkir því að minna af boðinu barst til nemans. Hún segir ekki ein og sér hvaða hlekkur brást.
Hlekkur 1: minna myndast af iNOS-ensími
Í átfrumum músa sem voru örvaðar með lípópólýsakkaríði úr bakteríum, interferóni gamma eða hvoru tveggja kom metýlenblátt í veg fyrir vænta aukningu á iNOS-próteini og bældi iNOS-boðbera-RNA mjög í umritunartilraununum á átfrumum. Það sem breyttist ekki er sérstaklega upplýsandi. Niðurbrot hemilsins I kappa B alpha, fosfórun NF kappa B og STAT1 og flutningur þessara þátta inn í kjarnann héldust að mestu óbreytt. Það sem minnkaði var binding þeirra við DNA, eins og staðfest var með ónæmisútfellingu litnis sem sýndi minni bindingu við stýrisvæði iNOS.
Þetta er áhrif á genastjórnun sem koma á undan breytingu á magni ensímsins, ekki bráð hömlun á ensími sem þegar er til staðar. Þetta tilheyrir bólguboðmiðlun, þar sem umritunarþættir þurfa að bindast stýrisvæði áður en prótein verður til. Þetta segir ekkert beint um sívirkt eNOS í æð í hvíld og ætti að lýsa því á þeim forsendum.
Hlekkur 2: NOS-ensímið sem er til staðar vinnur hægar
Rannsókn á rottum prófaði annað stig. Vakandi karlrottur fengu lípópólýsakkaríð í æð og þremur klukkustundum síðar annaðhvort saltvatn eða metýlenblátt, 3 mg á kg, í æð. Virkni köfnunarefnismónoxíðsyntasa í miðlæga grunnhluta undirstúku var síðan mæld með umbreytingu merkts arginíns í sítrullín í rannsókninni á NOS-virkni í undirstúku. Streita ásamt saltvatni einu og sér framkallaði nokkra kalsíumóháða virkni og lípópólýsakkaríð jók hana í um það bil tífalt gildi viðmiðunarhópsins. Metýlenblátt eyddi báðum framkölluðu þáttunum. Kalsíumháð sívirk starfsemi breyttist ekki í þessum vef við þennan skammt og á þessum tímapunkti.
Lestu niðurstöðuna nákvæmlega eins og hún er sett fram: mæld virkni af iNOS-gerð var bæld við þessar aðstæður. Þetta er ekki mæling á genatjáningu og ekki sönnun fyrir því að metýlenblátt hafi alltaf sértæk áhrif á iNOS fremur en eNOS eða nNOS. Rannsóknir á hreinsuðum ensímum undirstrika þörfina fyrir varfærni. Í beinum mælingum á hreinsuðum köfnunarefnismónoxíðsyntasa stöðvaði metýlenblátt myndun sítrullíns alveg við 30 míkrómólar. Styrkur fyrir helmingshömlun var um 5.3 míkrómólar án súperoxíðdismútasa og 9.2 míkrómólar með honum, eins og greint var frá í samanburðinum á hreinsuðum NOS og gúanýlatsýklasa. Sérstök rannsókn á hreinsuðu nNOS benti til að oxun ensímbundins hems ætti hlut að máli. Hagnýti lærdómurinn er sá að bein NOS-hömlun er raunveruleg í einangruðum kerfum, en ekki má yfirfæra niðurstöðuna úr undirstúkunni yfir í almenna fullyrðingu um að metýlenblátt hlífi öllum sívirkum NOS-ensímum alls staðar.
Hlekkur 3: köfnunarefnismónoxíð tapast áður en það kemst á áfangastað
Skýrasta dæmið um að annað en ensímhömlun geti skýrt lækkun á hringlaga GMP kemur úr ræktuðum sléttum vöðvafrumum lungnaslagæða kanína. Í tilrauninni var farið alveg fram hjá eigin NOS frumanna með því að bæta gjöfum köfnunarefnismónoxíðs beint við. Síðan var kannað hvort metýlenblátt bældi samt svörun hringlaga GMP í rannsókninni á súperoxíði í sléttum vöðvum æða.
Þrír gjafar voru prófaðir við 1 til 100 míkrómólar: S-nítrósó-L-sýstein, natríumnítróprússíð og stöðug afamíneruð hliðstæða sem kallast MPANO. Allir juku hringlaga GMP um það bil 1.5-falt til 12-falt. Metýlenblátt við 10 míkrómólar hamlaði áhrifum fyrstu tveggja um 51 til 100 prósent en lét MPANO-svörunina óbreytta. Ef metýlenblátt væri einfaldlega að hindra hvarfstöð sýklasans væri erfitt að útskýra þessa sértækni gagnvart gjöfunum, því allir þrír verka á sama ensímið neðar í boðleiðinni.
Þrjár viðmiðunartilraunir tengdu síðan verkunarháttinn við súperoxíð. Í fyrsta lagi gaf myndun súperoxíðs utan frumna með xantíni ásamt xantínoxídasa sama mynstur: áhrif CYSNO og nítróprússíðs voru hindruð en áhrifum MPANO hlíft. Í öðru lagi olli metýlenblátt skammta- og tímaháðri myndun súperoxíðs í sléttu vöðvafrumunum, mældri með afoxun cýtókróms c. Í þriðja lagi kom súperoxíðdismútasi alveg í veg fyrir hömlunina en katalasi ekki, sem bendir til súperoxíðs fremur en vetnisperoxíðs sem þess efnaforms sem olli áhrifunum í þessu rannsóknarkerfi.
Þess er vert að lýsa samræktunarútgáfu tilraunarinnar því hún staðsetur áhrifin. Æðaþelsfrumur á þekjuglerjum voru samræktaðar stuttlega með sléttum vöðvafrumum, þannig að æðaþelsþáttur sem losnaði við grunnástand jók hringlaga GMP í sléttu vöðvafrumunum þrefalt til áttfalt. Formeðferð annars hvors frumuhópsins með metýlenbláu dró úr þessu boði og súperoxíðdismútasi sneri að hluta við áhrifum formeðferðar æðaþelsins. Með öðrum orðum þarf metýlenblátt alls ekki að verka inni í sléttu vöðvafrumunni sem nemur boðið. Það getur dregið úr boðinu með því að fjarlægja boðefnið á leiðinni. Leiðbeiningarnar um lestur rannsókna á metýlenbláu setja þetta fram sem almenna reglu: nefndu fyrst hvar inngripið átti sér stað áður en þú nefnir sameindamarkið.
Rangt væri að kalla þetta NOS-hömlun. Ekkert syntasaþrep þurfti til að gjafarnir virkuðu, en samt dró úr boðinu.
Hlekkur 4: neminn sjálfur svarar minna
Bein áhrif á leysanlegan gúanýlatsýklasa eru til staðar, en styrkurinn skiptir máli. Í samanburðinum á hreinsuðum ensímum sem vitnað var í hér að ofan þurfti um 60 míkrómólar af metýlenbláu til að ná helmingshömlun á sýklasa sem köfnunarefnismónoxíð hafði örvað, samanborið við um 5 til 9 míkrómólar fyrir helmingshömlun á NOS. Jafnvel 1 millimólar olli aðeins hluta af mögulegri hámarkshömlun. Þetta er um það bil sex- til ellefufaldur munur. Frumutilraun við lágan míkrómólar styrk sem lækkar hringlaga GMP má því ekki lýsa sem sértækri sýklasahömlun á grundvelli gildis hringlaga GMP eins og sér.
Síðari rannsókn á oxunar-afoxunarferlum bætti við öðru varnaðarorði: metýlenblátt óvirkjaði sýklasa sem hafði verið virkjaður af köfnunarefnismónoxíði með öðrum hætti en einfaldri loftoxun járnsins í hemhópnum. Neminn getur því orðið fyrir skerðingu, en efnafræðin er ekki fullkomlega skýrð. Munurinn á styrknum þýðir að fyrst ætti að útiloka áhrif súperoxíðs og NOS við útsetningu fyrir lágum míkrómólar styrk. Hér eiga viðmiðunartilraunir með fosfódíesterasa einnig heima. Nema niðurbrot hafi verið mælt eða hindrað samræmist minni uppsöfnun hringlaga GMP minni nýmyndun, hraðara niðurbroti eða hvoru tveggja.
Hvers vegna þetta verður ekki dregið saman í eina fullyrðingu um blóðþrýsting
Hver hlekkur var staðfestur í ólíku kerfi. Umritun í átfrumum er ekki ensímvirkni í undirstúku. Virkni í undirstúku eftir lípópólýsakkaríð er ekki æðaþelsstýrður æðaspenna í hvíld. Æðaþelsþáttur sem losnar við grunnástand í samræktun er ekki æðavíkkun sem örvuð er af örva. Ræktaðar frumur úr lungnaslagæðum við 10 míkrómólar af metýlenbláu eru ekki blóðrás manns. Að fella þetta allt saman í fullyrðingu á borð við að metýlenblátt hækki blóðþrýsting með því að hindra köfnunarefnismónoxíð afmáir einmitt þann greinarmun sem viðmiðunartilraununum var ætlað að varðveita.
Þrjár athuganir halda frásögninni heiðarlegri. Í fyrsta lagi skal nefna ísóformið: eNOS fyrir æðaspennu í hvíld, iNOS fyrir framkallað flæði við bólgusvörun og nNOS í samhengi taugafrumna og sumra rannsókna á hreinsuðum ensímum. Í öðru lagi skal nefna hvernig köfnunarefnismónoxíðboðið berst: með eigin nýmyndun frumnanna, losun frá æðaþeli við grunnástand eða tilteknum gjafa eins og CYSNO, nítróprússíði eða MPANO, þar sem stöðugi gjafinn stóðst áhrif metýlenblás en þeir óstöðugu ekki. Í þriðja lagi skal nefna styrkinn og viðsnúning áhrifanna: viðsnúningur með súperoxíðdismútasa bendir til þátttöku súperoxíðs, skortur á áhrifum katalasa mælir gegn vetnisperoxíði í því rannsóknarkerfi, eftirlíking með xantínoxídasa sýnir að það nægir til að framkalla áhrifin og mælingar á hreinsuðum ensímum aðgreina bein áhrif á hvötun frá tapi á boðefni á leiðinni.
Stutt samantekt er þessi. Betra er að líta á metýlenblátt sem efni sem truflar boðleiðina frá köfnunarefnismónoxíði til hringlaga GMP á mörgum stöðum en sem sértækan sýklasahemil. Eftir rannsóknarkerfi og styrk getur það dregið úr bindingu umritunarþátta iNOS, hamlað NOS-ensímum beint, minnkað aðgengi að köfnunarefnismónoxíði með myndun súperoxíðs og skert sýklasa sem köfnunarefnismónoxíð hefur virkjað. Hlutverk boðmiðlunar með hringlaga GMP í æðarannsóknum og samanburður á gjöfum köfnunarefnismónoxíðs sem notaðir eru í frumumælingum fjalla hvort um sína grein þessarar boðleiðar nánar. Umfjöllunin um aðferðir sem aðgreina oxunar-afoxunaráhrif frá ensímáhrifum útskýrir hvers vegna súperoxíðdismútasi ásamt katalasa og viðmiðun með stöðugum gjafa koma svo oft fyrir í þessum rannsóknum.
Lágt gildi hringlaga GMP eftir metýlenblátt sýnir að keðjan hefur rofnað. Aðeins viðmiðunartilraunirnar segja til um hvaða hlekkur brast.