Mælingar á hvarfgjörnum súrefnistegundum í tilraunum með metýlenblátt

Tvær rannsóknarstofur framkvæma tilraun sem báðar kalla andoxunartilraun með metýlenblátt. Önnur greinir frá því að litarefnið bæli hvarfgjarnar súrefnistegundir. Hin greinir frá því að það myndi þær. Báðar sýna skýra skammtasvörunarferla. Báðar starfa af heilindum. Munurinn stafar hvorki af svikum né vanhæfni. Hann stafar af því að hóparnir mældu ólíka hluti við ólík birtuskilyrði, með mælinemum sem svara ólíkum spurningum, og lýstu svo báðum niðurstöðunum með sama orðinu: ROS.

Erfitt er að mæla metýlenblátt nákvæmlega vegna þess að sameindin tekur þátt í þeim efnahvörfum sem henni er ætlað að fylgjast með. Í myrkri flytur hún rafeindir milli gjafa og viðtakenda og snýr aftur í upphaflegt form sitt, tilbúin í næstu umferð. Við lýsingu verður hún ljósnæmandi efni og kemst í örvað triplett-ástand. Þaðan getur hún flutt orku til súrefnis og myndað súrefni í singlett-ástandi, eða flutt rafeindir og myndað stakeindir og vetnisperoxíð. Sérhver mælinemi sem settur er í slíkt kerfi getur oxast, afoxast, aflitast eða fengið ljósmerki sitt hulið af litarefninu sjálfu. Fyrsta spurningin við allar ROS-mælingar er því aldrei hver talan sé. Hún er hvað mæliaðferðin greini í raun og hvaða áhrif litarefnið hafi á mælinguna.

Amplex Red: kvörðuð mæling á vetnisperoxíði

Samsetningin metýlenblátt og Amplex Red er sú sem best stendur undir sér í þessum rannsóknarritum, þegar rétt er að mælingunni staðið. Efnahvarfið er sértækt: piparrótarperoxídasi notar vetnisperoxíð til að oxa Amplex-hvarfefnið í flúrljómandi myndefni, resorufin, í nokkurn veginn hlutfallinu einn á móti einum. Peroxíð úr sýninu verður að flúrljómun í nemanum. Engin önnur efni í hinum hefðbundna ROS-flokki knýja þetta hvarf beint.

Afgerandi kosturinn er kvörðunin. Vandvirkur rannsakandi mælir þekkta peroxíðstaðla í sömu stuðpúðalausn, með sama styrk peroxídasa og hvarfefnis, sama ræktunartíma og sömu ljósfræðilegu stillingum, og ber síðan mæligildi sýnanna saman við þann feril. Í rannsókninni á einangruðum hvatberum úr heila, sem þessi aðferð byggist á, gerðu höfundarnir nákvæmlega þetta. Þeir bættu þekktu magni peroxíðs við í lok hverrar mælingar og birtu niðurstöðurnar sem hraða í píkómólum á mínútu á milligramm prótíns, en ekki sem handahófskenndar flúrljómunareiningar. Það er þetta sem breytir ljóma í mælingu.

Þrjú atriði úr þeirri rannsókn eru þess virði að taka upp. Í fyrsta lagi staðfestu höfundarnir merkið með katalasa, sem eyðir peroxíði. Aukning flúrljómunar af völdum metýlenblás stöðvaðist þegar katalasa var bætt við. Það staðfesti að merkið stafaði af peroxíði en var ekki ljósfræðileg mælivilla. Í öðru lagi prófuðu þeir áhrif lýsingar beint með því að loka fyrir örvunargeislann þannig að sýnin fengju einn áttunda af venjulegum ljósskammti. Merkið minnkaði aðeins um níu prósent. Meira en níutíu prósent af peroxíðinu sem þeir greindu frá var óháð mælingarljósinu. Í þriðja lagi mældu þeir eyðingu peroxíðs sérstaklega með rafskauti og komust að því að litarefnið bæði jók myndun þess og hægði á brottnámi. Mælinemi sem sýnir aðeins nettóflúrljómun hefði blandað þessum tveimur áhrifum saman.

Mæliaðferðin getur þó enn brugðist og metýlenblátt veldur nokkrum slíkum vandamálum. Litarefnið gleypir ljós yfir breitt svið á sama rauða svæði og resorufin sendir frá sér ljós. Við háan styrk litarefnis getur sýnið því hulið eigið merki vegna innri síuáhrifa. Staðlar ættu því að innihalda sama styrk litarefnis og sýnin. Amplex Red getur einnig ljós oxast eitt og sér og myndefni þess, resorufin, getur tekið þátt í ljósdrifnum oxunar- og afoxunarhringrásum sem mynda súperoxíð og peroxíð. Þetta skiptir miklu máli þegar tilraunin felur einnig í sér að lýsa á ljósnæmandi efni. Hagnýta lausnin er að geisla fyrst sýnin með metýlenbláu og mæla síðan skammta úr þeim með Amplex-hvarfefnum í myrkri, í stað þess að lýsa á litarefnið og mælinemann saman. Að lokum bælir súperoxíðdismútasi ekki einfaldlega Amplex-merki: umbreyting súperoxíðs í peroxíð getur aukið það. SOD-viðmið sem eykur flúrljómun hefur ekki brugðist. Það hefur sýnt fram á súperoxíð sem efni fyrr í hvarfferlinu.

DCFDA: ósértækur vísir fyrir oxun

Samsetningin metýlenblátt og DCFDA er uppspretta meginhluta ruglingsins. DCFH-DA er forefni sem tekið er upp í frumur. Esterasar innan frumunnar fjarlægja asetathópa þess og skilja eftir DCFH, sem flúrljómar ekki. Oxun DCFH myndar síðan flúrljómandi DCF. Listinn yfir það sem oxar það er langur: hýdroxýlstakeindir, milliefni peroxídasa og hems, köfnunarefnisdíoxíð, undirklórsýra og stakeindir sem myndast úr peroxýnítríti. Vetnisperoxíð eitt og sér oxar það ekki beint á hraða sem gagnast við mælingar. Flúrljómun sem er háð peroxíði þarf yfirleitt járn, hemprótín eða peroxídasahvörf í ferlinu.

Gagnrýnin sem vísa ætti til í hverjum aðferðakafla kemur úr greiningu Kalyanaraman og samstarfsfólks á DCFH sem mælinema. Eins og tekið er saman í rannsókninni á hvatberum úr heila sem hafnaði DCFDA af þessum sökum sýndu þau fram á að litarefnið hvarfast hægt, með óþekktum hlutfallstölum efnahvarfa, án gildrar kvörðunar og við efnasambönd sem eru ekki ROS. Mælineminn magnar einnig það sem hann mælir: oxun DCFH með flutningi einnar rafeindar myndar DCF-stakeind sem hvarfast við súrefni og myndar súperoxíð, sem sundrast með dismútasahvarfi í meira peroxíð. Mælingin framleiðir að hluta þau efnahvörf sem hún greinir frá.

Ekkert af þessu gerir DCFDA gagnslaust. Það gerir það að skimunaraðferð, ekki auðkenningaraðferð. Aukning á flúrljómun DCF merkir að oxun mælinemans, háð oxandi efnum, hafi aukist. Hún merkir ekki að peroxíð hafi aukist og alls ekki að heildarmagn ROS hafi aukist, enda mælir enginn einn mælinemi þá stærð. Eldri rannsóknir á metýlenbláu sem byggðust á DCF-oxun við styrk yfir einu míkrómólari greindu frá oxunarhvetjandi áhrifum, en rannsóknir á öðrum kerfum á sama tíma greindu frá vernd gegn frumudauða af völdum peroxíðs. Báðar niðurstöður geta átt við um sama litarefni við ólík oxunar- og afoxunarskilyrði, og DCF-niðurstaðan ein getur ekki sagt hvaða oxandi efni bar merkið. Mikilvægi fyrri rannsóknarinnar á hvatberum úr heila felst í því að hún skipti þessari skimun út fyrir kvarðaða peroxíðmælingu og mældi álagið beint: jafnvel eitt hundrað nanómólar af litarefninu jók losun peroxíðs margfalt við öll þau hvarfefni og öndunarástand sem prófuð voru.

DCFDA hefur eina gildru til viðbótar sem er sértæk fyrir metýlenblátt. Litarefnið er mjög sterkt á litinn og virkt í oxunar- og afoxunarhvörfum. Það getur því aflitað flúrljómun, slökkt ljósútgeislun eða oxað mælinemann óháð ROS í frumunum. Frumulaust viðmið með litarefni og mælinema, en engum frumum, er ekki valfrjáls viðbót. Það er tilraunin sem segir þér hvort litarefnið hafi bein áhrif á mælinemann.

Spunagildrun og súrefnisupptaka: auðkenning og flæði

Þar sem flúrljómandi mælinemar sýna að eitthvað oxanlegt hafi komið fram sýnir rafeindaspunaómun með spunagildrum frekar hvað það hafi verið. Hin sígilda rannsókn á ljósefnafræði metýlenblás notaði ESR til að greina askorbatstakeindina sem myndaðist úr litarefni, askorbati og ljósi. Síðan sýndi hún fram á myndun peroxíðs í tilraunum með súrefnisupptöku og járnhvataða myndun hýdroxýlstakeinda í spunagildrunartilraunum. Hver tækni svaraði spurningu sem hinar gátu ekki svarað: ESR auðkenndi stakeindirnar, súrefnisupptaka sýndi hvarfflæði óháð flúrljómandi mælinemum og saman sýndu aðferðirnar að bæði ferlar með súrefni í singlett-ástandi og stakeindaferlar væru virkir í sama upplýsta kerfinu.

Þessi niðurstaða frá 1984 er enn eins og viðvörunarmerking. Við lýsingu og í nærveru afoxunarefnis myndaði litarefnið peroxíð. Þegar járn var einnig til staðar myndaði kerfið hýdroxýlstakeindina, hvarfgjörnustu tegundina í þessum hópi. Höfundarnir tengdu þetta við askorbat í auganu og drógu óvarkára notkun í augum í efa. Lesendur nú á dögum ættu að taka eftir skilyrðunum: ljós ásamt afoxunarefni og járni. Ef eitthvert þessara þriggja er fjarlægt veikist hvarfleiðin eða hverfur.

Súrefnisrafskaut réttlæta notkun sína með öðrum hætti. Rafskaut af Clark-gerð mælir nettósúrefnisnotkun. Það staðfestir að oxunar- og afoxunarhvörf sem litarefnið knýr noti sameindasúrefni og veitir upplýsingar um hvarfhraða sem engin flúrljómunarskekkja getur hermt eftir. Það auðkennir ekki myndefnið. Myndun peroxíðs, súperoxíðs og vatns, ásamt ferlum við hrörnun súrefnis í singlett-ástandi, felur öll í sér súrefnisnotkun. Flæði án auðkenningar er jafn ófullkomið og auðkenning án flæðis. Þess vegna sameina vandaðar rannsóknir rafskautsmælingu og kvarðaða peroxíðmælingu eða gildru.

Hvers vegna niðurstöður um andoxun stangast á

Þegar þessar þrjár mæliaðferðir eru bornar saman skýrast sýnilegar mótsagnir í rannsóknarritum um metýlenblátt með mismunandi aðferðum og þremur líffræðilegum staðreyndum.

Í fyrsta lagi er litarefnið bæði rafeindaflytjandi og uppspretta peroxíðs. Með því að beina rafeindum frá stöðum í öndunarkeðjunni þar sem súrefni myndi annars verða að súperoxíði getur það dregið úr einni ROS-tegund, á sama tíma og afoxað form þess afoxar súrefni beint í peroxíð og eykur þannig aðra. Rannsóknarstofa sem fæst við oxunar- og afoxunarefnafræði hvatbera og hjáleiðarhlutverk litarefnisins ætti því að búast við niðurstöðum sem ráðast af mælinemanum: mæligildi sem er næmt fyrir súperoxíði lækkar á meðan peroxíðmæligildi hækkar í sömu mælikúvettunni.

Í öðru lagi er peroxíð í litlu magni boðefni, ekki aðeins skaðvaldur. Rannsóknin á hvatberum úr músarheila sem fylgdi fyrri rannsókninni sýndi myndun peroxíðs við allt niður í fimmtíu nanómólar af litarefninu, án skemmda á DNA hvatbera við meðferðarstyrk, og vernd gegn skemmdum af völdum rótenóns eftir formeðferð. Aðeins við eitt hundrað míkrómólar, langt yfir meðferðarbilinu, skemmdi litarefnið valda DNA-búta. Rautt ljós ásamt tuttugu míkrómólar af litarefninu myndaði hins vegar súrefni í singlett-ástandi sem skemmdi alla bútana sem prófaðir voru. Verkunarhátturinn sem lagður er til er hormetískur: væg peroxíðmyndun virkjar andoxunarvarnir sem tengjast Nrf2 og nýmyndun hvatbera, þannig að mæling sem sýnir oxunarhvetjandi áhrif til skamms tíma kemur á undan andoxandi niðurstöðu til lengri tíma. Mæling eftir eina klukkustund og mæling eftir einn dag geta gefið ólíkar niðurstöður vegna þess að líffræðin breyttist á milli þeirra.

Í þriðja lagi ræður ljósið því hvaða sameind er yfirhöfuð til staðar. Lýsing fjarlægir metýlhópa úr litarefninu og færir það í átt að Azure B og skyldum myndefnum. Smásjárlampi yfir skál nægir til að virkja ljósnæmandi eiginleika þess. Tilraunir í myrkri og við lýsingu eru ólíkar tilraunir og kaflinn um viðmið fyrir lýsingu og meðhöndlun litarefnis í sérhverri tilraunalýsingu ætti að meðhöndla þær þannig.

Lágmarksviðmið og hvernig lesa á fullyrðingar

Samanburðurinn hér að neðan er upprunalegt viðmiðunarefni þessarar greinar. Áður en nokkur ROS-niðurstaða um metýlenblátt er samþykkt skal athuga hvaða raðir höfundarnir uppfylltu og hverjum þeir slepptu.

Af þessu leiðir hagnýt lestrarregla. Amplex með peroxídasa, kvörðun og katalasaprófun gefur vísbendingar um peroxíð. DCFDA gefur vísbendingar um ósértæka oxun mælinema og ekkert umfram það. Spunagildrun með viðmiðum sem innihalda stakeindafangara gefur vísbendingar um auðkenni stakeinda. Súrefnisupptaka gefur vísbendingar um flæði. Setning sem fullyrðir meira en mæliaðferðin getur stutt, hversu örugglega sem hún er orðuð, er setning um mælinemann en ekki um litarefnið. Tengdar umfjallanir um skammtaháð áhrif og hormetíska bilið, rafeindaflæði í hvatberum, truflun mæliaðferða í lituðum sýnum og mælivillur vegna smásjárlýsingar útfæra hvert þessara atriða nánar. Hvert þeirra stendur áfram þegar bráðabirgðatilvísun þess hefur verið skipt út.