Basísk og fjöllit metýlenblá litunarefni Loefflers útskýrð

Þrjár flöskur geta staðið hlið við hlið á litunarbekk, hver merkt með einhverri útgáfu af metýlenbláu. Á einni stendur 1% vatnslausn metýlenblás. Á annarri stendur basískt metýlenblátt Loefflers. Á þeirri þriðju stendur fjöllitt metýlenblátt. Starfsmaður sem hefur mikið að gera grípur þá sem er næst. Strokið litast síðan of dauft, of jafnt blátt eða í óvæntum fjólubláum tónum, og sýninu er kennt um niðurstöðuna.

Þetta er vandamál sem tengist samsetningu lausnarinnar, ekki sýninu. Lausnirnar þrjár innihalda skyld litarefni en byggjast á ólíkum meginreglum litunar. Ein er einfalt katjónískt litarefni við nær hlutlaust pH. Önnur er sama litarefnið með aukinni litunarvirkni vegna basa. Sú þriðja er ekki lengur eitt litarefni heldur blanda sem hefur verið oxuð af ásetningi. Ef röng lausn er notuð breytist meginregla litunarinnar í höndunum á þér.

Stutta svarið

Einföld vatnslausn metýlenblás er viðmiðið: um 1% litarefni í vatni, einfalt katjónískt litunarefni til að skoða lögun baktería og fyrir almenna smásjárskoðun. Í basísku metýlenbláu Loefflers er litlu, afmældu magni af þynntum basa bætt við stofnlausn í alkóhóli sem er þynnt með vatni. Það hækkar pH og eykur bindingu katjóníska litarefnisins við súrar byggingareiningar baktería. Fjöllitt metýlenblátt er metýlenblátt sem hefur verið látið þroskast með stýrðri oxun í basa. Flaskan inniheldur því blöndu af afmetýleruðum samstæðum efnum (azure A, azure B, azure C), þíóníni og metýlenfjólubláu ásamt metýlenbláu sem eftir er, og sú blanda litar ólíkar byggingareiningar í mismunandi litbrigðum.

Ef þú manst aðeins eina setningu: basun breytir styrkleika litunar, en fjöllitun breytir litunum sjálfum.

Venjuleg vatnslausn metýlenblás: viðmiðið

Einfaldasta samsetningin er metýlenblátt leyst í vatni, yfirleitt í styrknum 1% w/v, án basa og án oxunar. Litaða efnaformið er metýlþíóníníumkatjón með klóríði sem mótjón, lítið og flatt fenóþíazínlitarefni sem er lýst sem metýlþíóníníumklóríði í færslu PubChem um metýlenblátt. Sem katjón binst það fosfatgrindum kjarnsýra og súrum hópum á frumuveggjum baktería og litar frumur bláar á ljósum bakgrunni.

Kosturinn er fyrirsjáanleiki. Kjarnar og bakteríur verða blá. Birtuskilin eru hófleg. Örverur sem sjást illa geta litast dauflega, og það er einmitt takmörkunin sem Loeffler ætlaði að bæta úr. Til að kynna þér stærri flokk einfaldra bakteríulitunarefna sem þessi lausn tilheyrir má skoða yfirlit um einfalda bakteríulitun. Hér skiptir enn máli að staðfesta auðkenni efnisins: metýlblátt er allt önnur sameind, eins og útskýrt er í metýlblátt borið saman við metýlenblátt, svo leit í vörulista sem byggist eingöngu á litaheiti getur skilað röngum flokki litarefna.

Basískt metýlenblátt Loefflers: sama litarefnið með aukinni virkni

Klassísk uppskrift Loefflers sameinar stofnlausn metýlenblás í alkóhóli og þynntan basa í vatni. Í kennslubókaútgáfum eru notuð 0.3 g af litarefni í 30 mL af 95% etanóli ásamt 100 mL af 0.01% kalíumhýdroxíðlausn í vatni (eða, með jafngildum hætti, 30 mL af mettaðri metýlenblálausn í alkóhóli, 100 mL af eimuðu vatni og 1 mL af 1% KOH). Útkoman er vinnulausn með nálægt 0.3% litarefni og greinilega basískt pH. Tilbúnar vörur byggjast á sömu meginreglu, og í vörulista Thermo Fisher yfir litunarefni fyrir örverufræði eru basískt metýlenblátt Loefflers, fjöllitt metýlenblátt og vatnslausnir skráð sem aðskildar vörur með mismunandi notkunartilgang.

Basinn er lykilatriðið. Hækkun pH fjarlægir róteindir af karboxýl- og fosfathópum í sýninu og eykur þannig þéttleika neikvætt hlaðinna bindistaða. Stofnlausnin í etanóli heldur litarefninu jafnframt að fullu uppleystu svo það berst að þessum stöðum sem stakar sameindir. Niðurstaðan er hraðari og sterkari litun baktería en fæst með hlutlausri vatnslausn litarefnisins, með kunnuglegum djúpbláum stöfum og kokkum í venjulegu bakteríustroki. Litunartími er yfirleitt ein til þrjár mínútur og síðan er skolað með vatni.

Klassíska notkunin er litun á Corynebacterium diphtheriae sem hefur verið ræktuð á Loeffler-sermisæti: grannir, oft kylfulaga stafir með sterkt lituðum, metakrómískum Babes-Ernst-kornum úr geymdu fjölfosfati. Samspil ætisins og litunarefnisins á sér sögulegar rætur; hvort tveggja er eignað sama bakteríufræðingnum, og skýr aðgreining kornanna er ávinningurinn við greiningu. Auk vinnu með barnaveikibakteríur er litunarefnið notað við almenna bakteríulitun á strokum úr ræktunum, til að skoða lögun Neisseria í klínískum strokum og þegar Gram-litun er óþörf en einföld vatnslausn metýlenblás gefur of daufa litun. Þetta er einlitt litunarefni. Allt sem er súrt fær einhvern bláan tón. Þegar verklýsing krefst aðgreiningar með mismunandi litum getur basi einn og sér ekki veitt hana.

Ein hagnýt varúðarregla: basískar litarefnalausnir rýrna og mynda botnfall við geymslu og upptöku koltvísýrings. Rannsóknarstofur útbúa því annaðhvort hóflegt magn eða kaupa tilbúna lausn og virða geymsluþol hennar, í stað þess að halda áfram að nota gamla flösku sem skilur nú eftir botnfall á hverju smásjárgleri.

Fjöllitt metýlenblátt: eitt heiti, mörg litarefni

Fjöllitt metýlenblátt er framleitt úr sama litarefni en það er látið gangast undir stýrða oxun í basa, ferli sem sögulega var kallað þroskun eða fjöllitun. Öldrun í basísku umhverfi, hitun með karbónati eða oxun með efnum á borð við díkrómat fjarlægir metýlhópa af dímetýlamínósethópunum í áföngum. Afurðin er blanda: metýlenblátt sem eftir er ásamt azure B (einn metýlhópur fjarlægður), azure A og azure C (frekari afmetýlerun), þíóníni (að fullu afmetýlerað) og hliðarafurðum oxunar úr flokki metýlenfjólublárra efna. Hvert efni hefur eigið litbrigði og sækni í vefi, svo blandan gefur metakrómíska litun: kjarnar, korn, slímefni og brjósk fá hvert sína sérstöku tóna frá bláu til rauðfjólublás.

Þessi efnafræði er sú sama og liggur að baki hinum þekktu blóðlitunarefnum. Fyrstu rannsakendur komust að því að basað metýlenblátt litaði kjarna malaríusníkjudýra í fjólubláum tónum, en þroskaðar vatnslausnir þeirra voru óstöðugar og mynduðu botnfall innan nokkurra daga. Yfirlitið um hvernig fjólubláa blóðlitunarefnið varð til rekur hvernig Malachowski og Romanowsky nýttu þessi áhrif hvor í sínu lagi árið 1891, hvernig metanól var tekið í notkun til að gera litarefnisbotnfallið stöðugra og festa strok án hita, og hvernig Giemsa staðlaði síðar blönduna með afmældu azure B og eósíni ásamt glýseróli til stöðgunar. Nútímaleg litunarefni af Giemsa-gerð eru beinir afkomendur fjöllits metýlenblás ásamt eósíni, samsetningarinnar sem myndar Romanowsky-áhrifin. Nánari upplýsingar um samspilið við eósín og azure B-hlutann eru í litunarefni af Romanowsky-gerð og víxlverkun azure B og eósíns.

Þar sem fjöllitt metýlenblátt er blanda er það í eðli sínu minnst staðlað af þessum þremur. Nákvæmt jafnvægi litbrigða fer eftir oxunaraðferðinni og hversu langt oxunin gengur. Þess vegna selja birgjar fyrir vefjafræði það sem sérstaka vöru með eigin prófunum á litunareiginleikum, en ekki sem gamalt metýlenblátt Loefflers. Dæmigerð notkun felur í sér metakrómíska litun til að sýna korn mastfrumna, slímefni og brjósk, skoðun á smáatriðum plasmafrumna og litun Helicobacter pylori í vefjasneiðum með fjöllitum aðferðum af Goodpasture-gerð. Það er rétti kosturinn þegar markmiðið er aðgreining með litum, en rangur kostur þegar verklýsingin gerir ráð fyrir skýrri, einlitri útlínumynd baktería.

Samanburður á samsetningu og tilgangi

Lestu töfluna sem leiðbeiningar um val. Ef sýnið litast of dauft skaltu breyta pH-forsendunni og velja lausn Loefflers. Ef allt litast en ekkert sker sig úr skaltu breyta litarefnisforsendunni og velja fjöllitt metýlenblátt. Ef strok litað með lausn Loefflers sýnir kornin fallega en yfirmaðurinn spyr hvers vegna kjarnar og umfrymi séu eins blá, er svarið að ekkert basískt, einlitt litunarefni getur veitt þá aðgreiningu. Það verkefni tilheyrir fjöllitum litunarefnum og afleiddum blóðlitunarefnum þeirra.

Að forðast algengan rugling

Tvær villur skýra mestan hluta ruglingsins. Sú fyrri er að líta á lausn Loefflers sem jafngilda einfaldri metýlenblálausn vegna þess að báðar virðast bláar í flöskunni. Þær eru ólíkar hvað varðar pH og litunarstyrk, og ef hlutlaust litarefni er notað þar sem lausn Loefflers er tilgreind tapast einmitt sú aðgreining kornanna sem verklýsingin var miðuð við. Sú síðari er að líta á hvaða gamla eða óviljandi aldraða basíska blálausn sem er sem fjöllita. Óstýrð öldrun myndar óþekkta blöndu með óþekktum styrk, en raunverulegar fjöllitar lausnir eru framleiddar með skilgreindum oxunaraðferðum og, í þróun blóðlitunarefna, blandaðar með afmældu eósíni. Sagan er lærdómsrík hér: óstöðugu, þroskuðu vatnslausnirnar frá síðasta áratug 19. aldar viku fyrir stöðguðum metanóllausnum einmitt vegna þess að ekki var hægt að endurgera óstýrðar blöndur með sambærilegum hætti. Það er lærdómur sem vert er að hafa í huga áður en smásjárgler til greiningar er litað úr flösku með óvissan aldur.

Nákvæmni í heitum er lokaskrefið. Staðfestu vöruna í vörulistanum (vatnslausn, lausn Loefflers eða fjöllit lausn), litarefnisinnihaldið og fyrirhugaða notkun á merkimiðanum í stað þess að álykta út frá litnum. Samsetningarnar þrjár eiga sameiginlegan forföður litberans. Þær hafa ekki sama tilgang.