Litun kinnfrumna með metýlenbláu: hvað á að skoða

Nemandi setur dropa af sviflausn með kinnfrumum á smásjárgler, horfir í smásjána og sér næstum ekkert. Nokkrar daufar vofur líða yfir bjart sjónsviðið. Hún stillir skerpuna, eykur svo lýsinguna og ályktar loks að glerið sé tómt. Glerið er ekki tómt. Frumurnar eru þar. Þær eru nær gagnsæjar og einmitt það gagnsæi er vandamálið sem þessari litun er ætlað að leysa.

Það er þess virði að benda á þetta misræmi milli væntinga og myndar áður en verklýsingin hefst. Byrjendur búast við því að smásjá sýni smáatriði eins og aðdráttur myndavélar gerir fjarlægt skilti læsilegt. Bjartsviðssmásjá gerir nokkuð afmarkaðra: hún sýnir mun á ljósgleypni. Ólituð kinnfruma gleypir nánast ekkert ljós og skapar því nánast engan mun. Metýlenblátt skapar þennan mun. Það binst ójafnt inni í frumunni og gerir byggingu hennar sýnilega með birtuskilum. Þegar nemendur skilja þessa hugmynd verður hvert næsta skref rökrétt afleiðing fremur en fyrirmæli í uppskrift.

Bakgrunnsþekking á því hvernig einfaldar litanir auka birtuskil á rannsóknarstofu skólans kemur að gagni hér og upprifjun á uppsetningu bjartsviðssmásjár fyrir litun kemur í veg fyrir helming misheppnaðra sýna. Efnafræðin á bak við litinn er útskýrð í inngangi að notkun metýlenblás við smásjárskoðun, þar sem fjallað er um hvers vegna einmitt þetta litarefni kemur sífellt fyrir á rannsóknarborðinu.

Verklýsing fyrir kennslustofuna

Votsýnið hér að neðan er einfaldari kosturinn fyrir almenna kennslu. Hvorki þarf loga né festingu. Í sumum verklegum leiðbeiningum á háskólastigi er notað fest strok, sem er látið loftþorna og síðan hitafest í stutta stund, eins og í kinnstroksverkefni North Central Texas College sem birt er á Biology LibreTexts. Hitafesting er þó venja úr örverufræði en ekki forsenda þess að sjá þekjufrumur.

Það sem þarf: hrein smásjárgler og þekjugler, sæfðir einnota sýnatökupinnar (helst) eða nýir flatir tannstönglar, dropaflaska með 0.5 til 1 prósents vatnslausn af metýlenbláu, eimað eða afjónað vatn, þerripappír, hanskar og samsett ljóssmásjá með 100x og 400x heildarstækkun.

1. Skolið munninn með hreinu vatni. Þetta fjarlægir mataragnir sem annars litast sterkt og draga athyglina frá frumunum.
2. Hver nemandi tekur aðeins sýni úr eigin kinn. Strjúkið varlega innanverða kinnina með nýjum sæfðum sýnatökupinna. Þrýstið létt, ekki skafa. Hættið áður en nokkur óþægindi eða blæðing verða.
3. Veltið sýnatökupinnanum yfir miðju hreins smásjárglers þannig að eftir verði þunnt lag. Þunnt lag er mikilvægasta einstaka skilyrðið fyrir sýni sem auðvelt er að skoða. Þykkt hvítt lag litast í bláan massa sem ekki er hægt að greina.
4. Setjið einn dropa af metýlenbláu á strokið. Látið hann liggja á í 1 til 3 mínútur. Ein mínúta nægir í mörgum verklýsingum á háskólastigi; í vísindaverklegu handbók NCERT fyrir IX. bekk eru notaðar um 3 mínútur fyrir tímabundið sýni. Lengri tími er ekki betri og oflitun er algengasta tímaskekkjan.
5. Skolið varlega með eimuðu vatni eða dragið umframlitarefni burt með þerripappír samkvæmt verklýsingu skólans. Bakgrunnurinn ætti að verða ljósblár, ekki dökkblár.
6. Látið þekjugler síga niður skáhallt þannig að ein brún snerti fyrst og látið það síðan síga hægt. Þetta kemur í veg fyrir loftbólur.
7. Byrjið á lítilli stækkun til að finna frumurnar, staðfestið skerpu og miðjun og farið síðan í 100x og loks 400x. Við 400x skal aðeins nota fínstillingu.

Styrkur litarefnisins verðskuldar eina nákvæma skýringu. Verklýsingar í skólum miða yfirleitt við um 1 prósents vatnslausn af metýlenbláu. Sterkari stofnlausn eða langur litunartími dekkir bakgrunninn hraðar en kjarnann og snýr þannig við birtuskilunum sem verkefnið byggist á.

Örugg meðhöndlun kinnsýna

Kinnsýnum fylgja munnvatn og örverur úr eðlilegri munnflóru. Meðhöndlið því hvert ferskt strok sem hugsanlega smitandi efni þótt sýnagjafarnir séu heilbrigðir bekkjarfélagar. Í leiðbeiningum American Society for Microbiology um líföryggi á kennslurannsóknarstofum koma fram almennar meginreglur: metið áhættu áður en kennslustundin hefst, notið hanska, verjið augun þar sem hætta er á skvettum, þvoið hendur að lokum, sótthreinsið vinnuborð og fargið menguðum einnota hlutum samkvæmt samþykktu ferli fyrir líffræðilegan úrgang.

Fjórar kennslustofureglur ná yfir mesta hluta áhættunnar. Einn sýnagjafi fyrir hvern sýnatökupinna og hvert smásjárgler; aldrei deila þeim. Aðeins taka sýni úr sjálfum sér, aldrei úr sessunaut. Einnota sýnatökupinnar og tannstönglar fara beint í tilgreint úrgangsílát, aldrei aftur á vinnuborðið. Metýlenblátt litar húð og fatnað og ertir augu, svo nota skal hanska og fylgja venjulegum hreinlætisreglum við meðhöndlun litarefna. Ekki útvíkka verkefnið með því að rækta neitt úr strokinu og ekki spinna upp eigin aðferð við hitafestingu fersks efnis úr mönnum utan öryggisferla skólans.

Hvað á að skoða og hvers vegna það lítur svona út

Við 100x skal leita að breiðum, flötum, ljósbláum frumum með óreglulega sporöskjulaga eða marghyrndar útlínur. Þær liggja stakar eða í lausum lögum sem skarast. Hver fruma hefur yfirleitt einn dekkri bláan blett. Sá blettur er kjarninn. Takið líka eftir uppröðuninni: flöguþekjufrumur eru þunnar flísar, ekki kúlur. Þess vegna minna brúnir þeirra á sprunginn glerung fremur en kringlóttar blöðrur.

Við 400x sjást þrjú einkenni skýrt. Frumujaðarinn birtist sem þunn, dekkri lína sem afmarkar frumuna. Umfrymið fyllir innra rýmið með ljósum, jöfnum bláum lit. Kjarninn er dekkri og þéttari, oft sporöskjulaga og yfirleitt nálægt miðjunni, en ekki alltaf. Biðjið nemendur að skrá öll þrjú einkennin ásamt lögun og stækkun, því vinnublaðið biður um einmitt það.

Hér skiptir eitt nákvæmnisatriði máli sem mörg vinnublöð fara rangt með. Sýnilegi jaðarinn samsvarar svæðinu þar sem frumuhimnan er, en himnan sjálf, tvöfalt lípíðlag sem er um 7 til 10 nanómetrar að þykkt, er langt undir upplausnarmörkum skólasmásjár. Nemendur sjá sjónrænan jaðar frumunnar ásamt litarefni sem hefur safnast þar. Sami fyrirvari á við um frumulíffæri. Hvatberar, frymisnet, Golgi-fléttur og ríbósóm sjást ekki í þessu sýni. Hefðbundin ljóssmásjá greinir smáatriði niður í um 0.2 míkrómetra við góð skilyrði, eins og útskýrt er í bakgrunnsefni NCBI um smásjártæki í frumulíffræði, og flest fínbyggingaratriði eru undir eða nálægt þeim mörkum. Meiri tóm stækkun gerir myndina stærri án þess að bæta við smáatriðum.

Hvers vegna litast kjarninn dekkst? Metýlenblátt er katjónískt litarefni, jákvætt hlaðið í lausn, og tengist neikvætt hlöðnu efni í frumunni, einkum kjarnsýrum. Litni þéttir DNA í kjarnanum og því safnast þar mest af litarefninu. Umfrymi inniheldur RNA og aðrar hlaðnar sameindir og litast því líka, en dreifðar og ljósar. Mikilvægasti fyrirvarinn er þessi: metýlenblátt er ekki DNA-sértækt litarefni. Rannsóknir á dreifingu metýlenblás við myndgreiningu frumukjarna lýsa því hvernig katjónin tengist svæðum sem eru rík af kjarnsýrum. Eldri magnbundnar rannsóknir á bindingu metýlenblás í frumusýnum leiddu í ljós að mest af bundna litarefninu tengdist kjarnsýrum. Dökkur kjarni og ljóst umfrymi eru því mynstur birtuskila, ekki sameindagreining.

Mistök sem nemendur munu gera og hvernig á að túlka þau

Næstum hvert misheppnað sýni fellur í einn af fimm flokkum. Kennið nemendum að greina vandann í sýninu í stað þess að endurtaka ferlið í blindni.

Oflitun gerir frumur og bakgrunn jafndökk þannig að kjarninn hverfur í sjónsviðið. Lagið það með styttri litunartíma eða vandlegri skolun. Of lítil litun skilur eftir vofur sem hverfa þegar lýsingin er aukin; lengið tímann í þrjátíu sekúndna skrefum. Þykk strok mynda þétta massa af frumum sem skarast þannig að engar útlínur verða raktar; lausnin er verkleg, að dreifa þynnra næst, því engin skolun bjargar frumuhaug. Loftbólur birtast sem fullkomnir hringir með skörpum, dökkum jöðrum og trufla byrjendur sem taka þær fyrir frumubyggingar; leggið þekjuglerið aftur á, hægt og skáhallt. Örsmáir dökkir punktar dreifðir á eða í kringum frumurnar eru yfirleitt bakteríur úr eðlilegri munnflóru, eins og tekið er fram í skólaverklýsingum á borð við kinnfrumuverkefni Ingrid Science. Þeir staðfesta að munnurinn sé byggður lífverum, sem gæti orðið nemendum minnisstætt, en ekki er hægt að greina þá til tegundar í þessu verkefni og þá á ekki að teikna sem hluta frumunnar. Matarleifar og slímþræðir litast óreglulega og sterkt; upphaflega skolunin er til þess að draga úr þeim.

Hvað þetta verkefni getur ekki gert

Þetta er athugun í kennsluskyni, ekki greiningarpróf. Ekkert við útlit frumna í litun í kennslustofu getur greint sýkingu, krabbamein eða nokkurn sjúkdóm og ekki ber að lesa greinina sem vísbendingu um annað. Sýnið sýnir lögun, jaðar, umfrymi og kjarna við tvær stækkanir. Það sýnir ekki fínbyggingu frumuhimnunnar, smáatriði frumulíffæra eða hvaða sameindir eru til staðar. Að taka þessi takmörk skýrt fram verndar bæði vísindin og nemendurna: góður árangur er rétt merkt teikning með skráðri stækkun og litun, ekki ályktun um heilsufar.

Vinnublað fyrir nemendur og merktar smásjármyndir

Tvö verkefnisgögn fylgja þessari síðu: merkta smásjármyndin hér að ofan og vinnublaðið hér að neðan. Prentið eitt vinnublað fyrir hvern nemanda eða varpið því á skjá og látið nemendur afrita reitina í stílabækur.

Svona má nota það í 45 mínútna kennslustund: tíu mínútur í öryggisleiðbeiningar og sýnatöku, tíu mínútur í litun og undirbúning sýnis undir þekjugleri, fimmtán mínútur í skoðun og teikningu við báðar stækkanir og tíu mínútur í gátlistann og samanburð við merktu smásjármyndina. Atriðin á gátlistanum eru viljandi einföld verklagsatriði. Þunnt strok, réttur litunartími, kjarni dekkri en umfrymi, stækkun skráð. Nemandi sem getur merkt við öll fjögur hefur skilið hugmyndina sem kennslustundinni er ætlað að miðla: smásjár sýna mun og litun skapar þann mun sem vert er að sýna.