Hvers vegna metýlenblátt er notað sem mótlitun við sýruþolslitun

Tæknir skoðar hrákastrok eftir að öllu litunarferlinu er lokið. Rauðir stafir skera sig úr bláum bakgrunni og niðurstaðan er skráð sem sýruþolnir stafgerlar sáust. Daginn eftir sýnir annað gler einsleitan bláan bakgrunn án rauðra stafa og niðurstaðan er skráð sem neikvæð fyrir berklum. Önnur þessara niðurstaðna fullyrðir meira en glerið gefur tilefni til, og það er ekki sú fyrri.

Misskilningurinn snýst um hugmyndina að baki aðferðinni. Tæknirinn leit á bláa litarefnið sem hluta af efnafræðinni sem greinir bakteríurnar, eins og metýlenblátt hjálpaði til við að finna mýkóbakteríurnar. Það gerði það ekki. Þegar metýlenblátt snertir glerið er prófinu þegar lokið. Litarefnið litar aðeins bakgrunninn svo hægt sé að lesa niðurstöðuna. Þessi grein útskýrir hlutverk metýlenblás í sýruþolslitun, hvers vegna það er blátt fremur en einhver annar litur og hvaða ályktanir má draga af rauðu á bláum bakgrunni.

Stutta svarið

Sýruþolslitun er aðgreiningarpróf sem byggist á þremur hugmyndum. Karból-fúksíni, aðallitarefninu, er þrýst inn í allar frumur, þar á meðal vaxkenndar mýkóbakteríur. Sýru-alkóhól, aflitunarefnið, fjarlægir rauða litarefnið úr venjulegum frumum en nær því ekki úr sýruþolnum frumum. Metýlenblátt, mótlitarefnið, litar síðan allt sem aflitunarefnið tæmdi. Frumur sem eru ekki sýruþolnar, hýsilfrumur og leifar verða því bláar á meðan sýruþolnir stafgerlar haldast rauðir. Mótlitunin skapar litaskil. Hún á engan þátt í þeirri efnafræði sem gerir frumu sýruþolna.

Hlutverk hvers skrefs

Myndin hér að neðan sýnir verkaskiptinguna. Lestu hana frá vinstri til hægri sem verklýsingu og neðstu röðina sem áminningu um að hver flokkur litunaraðferða svarar ólíkri spurningu.

Fyrst kemur innflæði. Mýkóbakteríur standast venjuleg litarefni í vatnslausn vegna þess að frumuhjúpur þeirra er óvenju vatnsfælinn, svo verklagið þvingar litarefnið inn. Í Ziehl-Neelsen-aðferðinni knýr hitun að gufumyndun fenólríkt karból-fúksín í gegnum vaxkenndan vegginn. Í köldu Kinyoun-aðferðinni kemur mun sterkari samsetning aðallitarefnis í stað hitunar og í sumum breyttum aðferðum án hitunar er yfirborðsvirkum efnum bætt við. Verklagsreglur American Society for Microbiology um sýruþolslitun sýna báðar samsetningarnar hlið við hlið og styrkleikamunurinn er sláandi: um 0.3 g af basísku fúksíni í hverjum 100 mL fyrir hitunaraðferðina á móti um 4 g fyrir köldu aðferðina.

Næst kemur aðgreining. Sýru-alkóhól, yfirleitt 3 mL af óþynntri saltsýru í 97 mL af 95 prósent etanóli, skolar rauða litarefninu úr öllum frumum sem hafa ekki sérstakt viðnám í frumuveggnum. Frumur með heilan lípíðhjúp mýkóbaktería halda litarefninu. Öll aðferðin byggist á þessu skrefi og það er viðkvæmast fyrir framkvæmdinni, eins og fjallað er um hér að neðan.

Litaskilin koma síðast. Á glerinu eru nú rauðar sýruþolnar frumur á nær litlausum bakgrunni frumna sem hafa misst litarefnið. Metýlenblátt í styrkleikanum 0.3 prósent w/v gerir bakgrunninn sýnilegan á ný, í lit sem sker sig sem mest frá rauðu. Mótlitunin er stutt, yfirleitt 20 til 30 sekúndur í hitunaraðferðinni og allt að nokkrar mínútur í sumum afbrigðum köldu aðferðarinnar. Tíminn ræðst af verklagsreglunum fremur en eiginleikum litarefnisins sjálfs.

Hvers vegna þetta litarefni og hvers vegna blátt

Metýlenblátt er katjónískt basískt litarefni. Það þýðir að litaða jónin ber jákvæða hleðslu og binst neikvætt hlöðnu yfirborði aflitaðra baktería, hýsilfrumna og leifa. OpenStax Microbiology lýsir þessu samspili hleðslna sem almennu meginreglunni að baki basískum litarefnum. Metýlenblátt er þó ekki efnafræðilega einstakt í þessu samhengi. Kristalfjólublátt og safranín eru líka basísk litarefni. Valið snýst um sjónræna eiginleika, ekki efnafræði.

Rauðir stafir þurfa bakgrunn í andstæðum lit og blátt myndar gagnlegustu andstæðuna við rautt í bjartsviðssmásjárskoðun. Safranín væri lélegt mótlitarefni vegna þess að bleikrauður lokálitur þess er of líkur karból-fúksíninu sem situr eftir og eyðir því þeim litamun sem aðferðin skapaði. Kristalfjólublátt myndi gefa dökkfjólubláan bakgrunn sem keppti við granna rauða stafgerla um athyglina. Sterkasta vísbendingin um að hlutverkið sé að skapa litaskil fremur en að taka þátt í efnafræðinni er að hægt er að skipta litarefninu út: græn mótlitarefni, svo sem malakítgrænt og skærgrænt, eru notuð í sumum dýralækningaaðferðum og breyttum verklagsreglum. Prófið virkar samt, því hvaða greinilega frábrugðni litur sem er gegnir sama hlutverki.

Af þessu leiða tvö hagnýt atriði. Í fyrsta lagi kveður staðlaða uppskriftin ekki á um neina pH-stillingu. Ekki rugla þessari einföldu 0.3 prósent vatnslausn saman við basískar samsetningar á borð við metýlenblátt Loefflers, sem tilheyra annarri litunarhugmynd. Í öðru lagi skaðar of mikil litun. Í vefjafræðiritum er sérstaklega varað við því að of þéttur blár bakgrunnur geti hulið fáa stafgerla. Að láta litarefnið liggja á glerinu lengur en verklagsreglurnar leyfa skerðir því læsileikann án nokkurs ávinnings.

Efnafræði frumuveggsins sem gerir prófið mögulegt

Ástæðan fyrir því að sýru-alkóhól aðgreinir frumurnar liggur í frumuhjúp mýkóbaktería. Burðargrind hans er mýkólýl-arabínógalaktan-peptídóglýkan-fléttan: peptídóglýkan tengt arabínógalaktani, en ytri endar þess bera mjög langar mýkólsýrukeðjur. Þær mynda lípíðríka ytri mýkóhimnu með óvenju litlu gegndræpi. Yfirlitsgrein um ytri himnu mýkóbaktería lýsir þessari byggingu í smáatriðum. Hindrunin virkar í báðar áttir. Hún hamlar innflæði litarefnis, þess vegna þarf hita eða sterkara aðallitarefni til að koma því inn, og hún hamlar útdrætti litarefnis, þess vegna nær sýru-alkóhól ekki að fjarlægja karból-fúksín þegar það er komið inn. Venjulegar bakteríur hafa ekki þennan hjúp og missa litarefnið. Sýruþol er því best skilið sem afleiðing lípíðhindrunar, ekki sem efnafræðileg binding fúksíns við mýkólsýru.

Þessi efnafræði skýrir einnig algenga ráðgátu: mýkóbakteríur litast illa og ófyrirsjáanlega með Gram-aðferðinni og birtast stundum sem dauf perlulaga form eða ólitaðar draugafrumur. Vatnsfælinn veggur þeirra takmarkar innflæði kristalfjólublás. Sýruþolslitun er ekki breytt Gram-litun. Hún byggist á annarri aðgreiningarreglu sem nýtir annan eiginleika frumuveggsins, eins og samanburðurinn á einfaldri litun og Gram-litun sýnir fyrir hinar tvær aðferðirnar.

Þrjár aðferðir, þrjár spurningar

Um breiðari flokk bakteríulitunaraðferða með einu litarefni má lesa í yfirliti um smásjárlitanir.

Hvað rautt á bláum bakgrunni getur ekki sannað

Rauðir stafir merkja að lífverurnar héldu karból-fúksíni þrátt fyrir sýru-alkóhól. Sú niðurstaða samræmist Mycobacterium tuberculosis, en leiðbeiningar CDC um berklagreiningu taka sérstaklega fram að aðrar mýkóbakteríur séu einnig sýruþolnar. Tegundagreining krefst því ræktunar og kjarnsýruprófa, ekki litar.

Villur í framkvæmd tengjast einkum skolununum tveimur. Ófullnægjandi aflitun skilur bakgrunnsefni eftir rautt og getur leitt til falskt jákvæðrar aflestrar. Of mikil aflitun fjarlægir aðallitarefni sem helst illa og stuðlar að falskt neikvæðum niðurstöðum. Of mikil mótlitun felur fáa stafgerla í blámanum. Þykk strok, útfelld hvarfefni og mengað skolvatn bæta við sínum eigin sýndarmerkjum.

Næmi takmarkast af fjölda lífvera, sama hversu vel framkvæmdin tekst. Hefðbundin smásjárskoðun stroka krefst um 5,000 til 10,000 stafgerla í hverjum millilítra hráka. Eldri samantektir CDC á rannsóknargögnum töldu næmi strokskoðunar vera um 45 til 80 prósent meðal tilfella lungnaberkla sem höfðu verið staðfest með ræktun. Neikvætt strok útilokar því aldrei berkla. Núgildandi leiðbeiningar CDC gera ráð fyrir ræktun samhliða hverju stroki og mæla með kjarnsýrumögnunarprófi á að minnsta kosti einu sýni úr öndunarfærum þegar grunur er um lungnaberkla og niðurstaðan myndi breyta klínískri meðferð.

Verkleg vinna verður að fylgja viðurkenndum verklagsreglum

Fræðslulýsingar, þar á meðal þessi grein, veita ekki heimild til klínískrar vinnu. Við vinnu á rannsóknarstofu skal fylgja fullgiltum stöðluðum verklagsreglum stofunnar sem samræmast núgildandi skjölum CDC, APHL eða CLSI. Viðmiðunarrit CDC um sýruþolslitun í Stacks-skjalasafninu sýnir hvernig slíkar verklagsreglur skilgreina hvarfefni og aflestur. Vinna með berklasýni krefst líföryggisráðstafana: strok eru útbúin í líföryggisskáp vegna þess að undirbúningurinn myndar úða og slettur. Leiðbeiningar CDC um öryggi á rannsóknarstofum taka fram að jafnvel hitafest strok geti innihaldið lifandi berklastafgerla og þurfi enn að meðhöndla sem menguð. Færsla í myndasafni CDC um lýðheilsu sem sýnir strok litað með karból-fúksíni og metýlenbláu og skoðað með tilliti til M. leprae minnir vel á að aðferðin nær lengra en til berkla: sömu rauðu og bláu litaskilin nýtast hvar sem leitað er að sýruþolnum lífverum, og vandlega staðfest neikvæð niðurstaða er sjálf þess virði að skrá.

Aflestur fullbúins glers

Mótlitunin sýnir gildi sitt við skimun. Sá sem skoðar glerið í lítilli stækkun notar fyrst bláa bakgrunninn til að meta gæði stroksins: jafna dreifingu frumna, heilar hýsilfrumur til að stilla skerpu og enga mikla útfellingu. Rauð fyrirbæri sem koma til greina draga síðan að sér augað einmitt vegna þess að ekkert annað á glerinu er rautt. Staðfesting fer fram með olíudýfu, þar sem raunverulegir stafgerlar sýna þá grönnu, stundum örlítið bognu eða perlulaga stafi sem búist er við, fremur en einsleitar litarefnisleifar.

Bakgrunnslitunin mótar einnig orðalag niðurstöðunnar. Gler með rauðum stafgerlum er skráð sem sýruþolnir stafgerlar sáust, oft með hálfmagnbundinni stigun samkvæmt kvarða rannsóknarstofunnar. Gler þar sem engar rauðar lífverur sjást er skráð sem engir sýruþolnir stafgerlar sáust, aldrei sem neikvætt fyrir berklum. Munurinn skiptir máli vegna þess að blái bakgrunnurinn sýnir að litunin virkaði, frumur tóku upp mótlitarefni og sjónbúnaðurinn var fullnægjandi, en segir ekkert um lífverur undir greiningarmörkum. Blár bakgrunnur án rauðra stafa er gild niðurstaða um glerið, ekki úrskurður um sjúklinginn.

Mundu verkaskiptinguna og orðalag niðurstaðnanna verður sjálfgefið. Karból-fúksín greinir hugsanlega sýruþolna gerla. Sýru-alkóhól framkvæmir prófið. Metýlenblátt gerir aðeins svarið læsilegt: rautt hélt litarefninu þrátt fyrir sýru, blátt missti það. Allt annað, tegund, magn og klínísk þýðing, kemur úr vinnu sem nær út fyrir glerið.