Einföld litun með metýlenbláu samanborið við Gram-litun: hvað hvor aðferð getur sýnt fram á

Nemandi útbýr strok úr rækt sem er merkt E. coli, þekur það með metýlenbláu í eina mínútu, skolar og skoðar í gegnum olíudýfilinsu. Bláar staflaga frumur þekja sjónsviðið. Í rannsóknarskýrslunni stendur: „Gram-neikvæðar stafbakteríur greindar sem E. coli.“ Athugunin er rétt. Niðurstaðan er ekki studd af þessu smásjárgleri.

Villan felst í hugtakaskilningi, ekki framkvæmdinni. Nemandinn fór með einfalda litun eins og hún væri aðgreiningarpróf. Einföld litun og Gram-litun svara ólíkum spurningum vegna þess að þær byggjast á ólíkum litunarhugmyndum. Önnur spyr: hvaða lögun er til staðar. Hin spyr: hvernig bregst frumuveggurinn við þegar á hann reynir. Ef þessu tvennu er ruglað saman getur rétt litað smásjárgler leitt til órökstuddrar skýrslu.

Þessi samanburður heldur aðferðunum tveimur aðskildum, sýnir hvaða fullyrðingar hver niðurstaða styður og svarar þeim tveimur spurningum sem nemendur spyrja oftast: má nota metýlenblátt við Gram-litun og hvað sýnir litun á E. coli með metýlenbláu í raun.

Stutta svarið

Einföld litun með metýlenbláu gefur öllum frumum sem taka lit sama bláa litinn. Hún sýnir því formgerð (stafi, kúlur, gorma) og uppröðun (stakar frumur, pör, keðjur), en segir ekkert um Gram-flokkun. Við Gram-litun er joði, aflitunarskrefi og mótlitarefni bætt við. Hún aðgreinir því bakteríur í Gram-jákvæðar (fjólubláar) og Gram-neikvæðar (bleikar eða rauðar) eftir því hvernig frumuveggir þeirra og himnur halda í litarefnið. Bláar staflaga frumur eftir litun með metýlenbláu merkja „staflaga frumur eru til staðar“. Bleikar staflaga frumur eftir fulla Gram-litunarröð merkja „Gram-neikvæðar stafbakteríur eru til staðar“. Seinni fullyrðingin er sterkari vegna þess að aðferðin fól í sér viðbótarpróf.

Um þann breiðari flokk aðferða til bakteríulitunar með einu litarefni sem þessi grein tilheyrir má lesa í yfirliti yfir litun fyrir smásjárskoðun.

Einföld litun: eitt litarefni, ein spurning

Metýlenblátt er basískt (katjónískt) litarefni. Litaða jónin ber jákvæða hleðslu og binst neikvætt hlöðnum byggingareiningum í frumunni, þar á meðal kjarnsýrum og súrum hópum á yfirborðinu. Frumur birtast því bláar á ljósum bakgrunni. OpenStax lýsir þessari meginreglu jákvæðrar litunar í kafla sínum um litun. Litarefniskatjónin sjálf er litla, flata fenóþíasínjónin sem er lýst nánar í viðmiðunargreininni um efnafræði metýlenblás; klóríðmótjónin sér ekki um litunina.

Hefðbundin verklýsing í kennslu er vísvitandi einföld: útbúið þunnt strok, látið loftþorna, festið með hita, þekið með um 1% vatnslausn af metýlenbláu í um eina mínútu, skolið varlega með vatni, þerrið og skoðið með olíudýfingu. Kennsluverklýsing á LibreTexts tilgreinir nákvæmlega þessa 1% lausn og einnar mínútu litun, en tekur fram að sumar rannsóknarstofur lengi tímann. Ekkert litfestiefni, ekkert aflitunarefni, ekkert annað litarefni. Það er einmitt tilgangurinn. Með aðeins einu litarefni og engri sértækri aflitun fá allar frumur sem binda litarefnið sama lit.

Þegar um E. coli er að ræða má búast við bláum staflaga frumum (stafbakteríum), stökum, í pörum eða litlum hópum. Blái liturinn kemur frá litarefninu. Staflögunin kemur frá lífverunni. Saman auðkenna þau þó ekki lífveruna, því margar tegundir eru staflaga og margar stafbakteríur litast bláar við einfalda litun. ATCC tekur skýrt fram í leiðbeiningum sínum um örveruræktun að þessi aðferð takmarkist við formgerð. Rétt skýrsla segir: „bláar stafbakteríur sáust“. Allt umfram lögun og uppröðun krefst frekari gagna.

Gram-litun: fjögur hvarfefni, eitt próf á viðbrögðum

Gram-litun er aðgreiningarlitun. Allar frumur fara í gegnum sömu skref og síðan er athugað hvaða frumur halda fyrsta litarefninu og hvaða frumur missa það. Verklýsingar American Society for Microbiology fyrir Gram-litun skilgreina hefðbundna röð fjögurra skrefa: kristalfjólublátt (frumlitarefni), Gram-joð (litfestiefni), alkóhól eða asetón-alkóhól (aflitunarefni) og síðan safranín (mótlitarefni).

Hefðbundið skýringarlíkan í kennslu skýrir aðgreininguna út frá byggingu frumuveggja og himna. Gram-jákvæðar frumur hafa þykkan peptídóglýkanvegg sem tapar vatni og heldur í kristalfjólublátt–joð-komplexinn við alkóhólþvottinn. Gram-neikvæðar frumur hafa þunnt peptídóglýkanlag ásamt fituríkri ytri himnu sem aflitunarefnið raskar. Komplexinn skolast því út og frumurnar taka síðan upp safranín. Yfirlitsgrein NCBI Bookshelf um Gram-litun gefur þessa skýringu á hlutverki frumuveggsins. Sérfræðingar bæta við að eðlisefnafræðin í heild sé flóknari en þykkt veggjarins ein og sér. Við túlkun á rannsóknarstofu gildir þó reglan um viðbrögðin: fjólublátt merkir að litarefnið varð eftir, bleikt merkir að það fór út og fruman var síðan mótlituð.

Myndspjöld til skýringar. Stílfærðar teikningar til samanburðar á aðferðum, ekki ljósmyndir teknar í smásjá. Litirnir eru einfaldaðir til að skýra röksemdina: einn litur við einfalda litun, tveir litir eftir aflitun í Gram-litun.

Má nota metýlenblátt við Gram-litun

Þessa spurningu má skilja á tvo vegu og svörin þurfa að vera ólík.

Fyrri túlkun: getur ein þekjun með metýlenbláu komið í stað allrar Gram-litunarraðarinnar. Nei. Án joðs, aflitunarefnis og mótlitarefnis er ekkert aðgreiningarskref, svo Gram-flokkun er ekki prófuð. Blátt sjónsvið eftir metýlenblátt eitt og sér er niðurstaða einfaldrar litunar, jafnvel þótt flaskan standi við hliðina á hvarfefnunum fyrir Gram-litun. Ekki skrá það sem niðurstöðu Gram-litunar.

Seinni túlkun: getur metýlenblátt komið í stað safraníns sem mótlitarefni í skrefi 4. Það getur litað aflituðu frumurnar og samkvæmt kennslubókaræfingu ættu Gram-jákvæðar frumur að verða fjólubláar og Gram-neikvæðar frumur bláar eftir slík skipti. Röksemdin er traust því rétt aflitaðar Gram-neikvæðar frumur eru nær litlausar og taka upp annað katjónískt litarefni. Þetta er þó ekki hefðbundna verklýsingin. Verklýsingar ASM tilgreina safranín, með viðurkenndum valkostum á borð við basískt fúksín í sumum afbrigðum, en ekki metýlenblátt. Þessu fylgir líka hagnýtur ókostur: erfiðara er að greina blátt frá fjólubláu en bleikt frá fjólubláu, sérstaklega fyrir byrjendur og einkum þegar lampar smásjárinnar eru orðnir daufir. Í námsverkefnum og þegar niðurstaðan skiptir máli skaltu nota mótlitarefnið sem verklýsingin tilgreinir, yfirleitt safranín, og líta á mótlitun með metýlenbláu sem sýnikennsluafbrigði fremur en jafngilda staðlaða aðferð.

Skyldri spurningu um hvernig metýlenblátt ber saman við önnur litarefni fyrir einfalda litun er svarað í samanburði á einföldum bakteríulitunum.

Hvað litun á E. coli með metýlenbláu sýnir fram á og hvað ekki

E. coli er Gram-neikvæð stafbaktería, en sú setning sameinar staðreyndir úr nokkrum aðferðum: formgerð úr smásjárskoðun, Gram-svörun úr Gram-litun og tegundagreiningu úr ræktun ásamt lífefnafræðilegum eða sameindafræðilegum prófum. Strok litað með metýlenbláu leggur aðeins til fyrsta hlutann. Það sýnir fram á að staflaga frumur séu til staðar í litaða sýninu og hvernig þær raðast. Það staðfestir ekki Gram-svörun, því ekkert aflitunarpróf var framkvæmt. Það auðkennir ekki tegundina, því staflaga frumur margra tegunda líta eins út við þessa upplausn.

Hér fara skýrslur úrskeiðis á fyrirsjáanlegan hátt. Höfundurinn færir bakgrunnsþekkingu („þessi rækt á að vera E. coli og E. coli er Gram-neikvæð“) inn í lýsinguna á athuguninni. Smásjárglerið virðist því staðfesta það sem í raun var gengið út frá. Skýrari skýrsla aðskilur þessi atriði: „Einföld litun með metýlenbláu: bláar stafbakteríur sáust; aðeins formgerð, Gram-flokkun ekki prófuð.“ Síðan, ef Gram-litun var framkvæmd rétt með viðmiðunarsýnum: „Gram-litun: bleikar staflaga frumur, samræmist Gram-neikvæðum bakteríum.“ Tegundagreining kemur síðar, úr greiningarferlinu, ekki út frá litnum einum.

Hagnýtar leiðbeiningar um túlkun

Notaðu þessa ákvörðunarreglu við vinnuborðið. Ef allar frumur eru í einum lit og verklýsingin notaði eitt litarefni án aflitunarefnis framkvæmdirðu einfalda litun. Skráðu lögun, áætlaða stærð og uppröðun. Láttu þar staðar numið. Ef verklýsingin fól í sér kristalfjólublátt, joð, aflitunarefni og mótlitarefni ásamt þekktum jákvæðum og neikvæðum viðmiðunarsýnum framkvæmdirðu Gram-litun. Skráðu lit ásamt formgerð: fjólubláar kúlubakteríur í keðjum, bleikar stafbakteríur og svo framvegis.

Þrjú mistök skýra mestan rugling. Í fyrsta lagi að túlka bláar staflaga frumur sem staðfestingu á E. coli. Í öðru lagi að skrá smásjárgler litað með metýlenbláu undir fyrirsögninni „Gram-litun“ í vinnubók, sem síðari lesendur munu mistúlka. Í þriðja lagi að skipta um mótlitarefni án umhugsunar og bera síðan saman liti milli rannsóknarstofa eins og litirnir væru þeir sömu. Lausnin á öllum þessum mistökum er sú sama: nefndu aðferðina sem var í raun framkvæmd og fullyrtu aðeins það sem sú aðferð prófar.

Einföld litun á rétt á sér einmitt vegna þess að hún styður takmarkaðar fullyrðingar. Hún er fljótleg, þolir smávægileg frávik í framkvæmd og nægir þegar spurningin snýst um formgerð: er eitthvað til staðar og hvaða lögun hefur það. Þegar spurningin snýst um flokkun skaltu framkvæma aðgreiningarprófið. Bláa smásjárglerið sýnir þér hvernig frumurnar líta út. Fjólubláa eða bleika smásjárglerið sýnir þér hvernig veggir þeirra bregðast við. Hvorugt smásjárglerið segir þér eitt og sér hvaða tegund er til staðar.