Մեթիլենային կապույտը զեբրադանիոյի հետազոտություններում․ խնամքի հավելանյութ և փորձի արդյունքները շփոթեցնող գործոն

Զեբրադանիոյի ձկնկիթի ջուրը հաճախ թեթև կապույտ է, և գրեթե ոչ ոք չի արձանագրում պատճառը։ Ներկանյութը մեթիլենային կապույտն է, որն ավելացվում է սնկերի դեմ, իսկ արձանագրությունների մեծ մասը դրան վերաբերվում է որպես ֆոնային բաղադրիչի։ Այստեղ «ֆոնային» հասկացությունը տեղին չէ։ Ավելի ճիշտ է այն համարել չարձանագրված փորձարարական գործոն․ մի նյութ, որն առկա է ազդեցության ենթարկված խմբերի տարաներում և բացակայում է վերահսկիչներում, կիրառվող կոնցենտրացիաներում դեղաբանական ակտիվություն ունի և կարող է փոխել հենց այն վերջնակետերը, որոնք չափում է փորձը։

Այս տարբերակումը ստորև ներկայացված ամեն ինչի հիմքն է։ Սովորական հակասնկային խնամքը մի հարց է։ Հավելանյութի չեզոքությունը ձեր փորձի նկատմամբ՝ մեկ այլ։ Զեբրադանիոյի վերաբերյալ վերջին գիտական գրականությունը առաջին հարցին տալիս է հանգստացնող, իսկ երկրորդին՝ անհանգստացնող պատասխան։

Ինչ են իրականում սահմանում ուղեցույցները

Միասնական չափորոշիչ չկա, և դա խնդրի մի մասն է։ Կենդանիների խնամքի Կանադայի խորհրդի ուղեցույցը թույլատրում է 0.5 mg/L կամ 0.00005% կոնցենտրացիա ձկնկիթի և թրթուրների տեղափոխման լուծույթում՝ սնկերի աճը նվազեցնելու համար։ Լաբորատոր կենդանիների վերաբերյալ եվրոպական ուղեցույցը նկարագրում է սաղմերի պահպանումը միջավայրում, որը հաճախ պարունակում է նույն 0.00005%-ը։ Cold Spring Harbor-ի E3 բաղադրատոմսը որպես բաղադրիչ սահմանում է դրա կրկնապատիկը՝ 1 mg/L կամ 0.0001%։ Սրա կողքին աչքի է ընկնում մի բացթողում․ OECD-ի՝ ձկան սաղմերի թունավորության փորձարկման ուղեցույցը սահմանում է վերակազմված նոսրացման ջրի և փորձարկվող քիմիական նյութի օգտագործում՝ առանց մեթիլենային կապույտի վերաբերյալ առաջարկության թե՛ 2013 թվականի տարբերակում, թե՛ հետագա վերանայման մեջ։ Այսպիսով, մի լաբորատորիան զեբրադանիոյի սաղմերը կյանքի առաջին ժամերից աճեցնում է մեթիլենային կապույտով կապույտ ջրում, մյուսը կարգավորող պահանջներով նախատեսված սաղմային փորձարկումն անցկացնում է թափանցիկ ջրում, և երկուսն էլ իրենց միջավայրը համարում են սովորական։ Լաբորատորիաների արդյունքները համեմատող կամ նախկին վերահսկիչ տվյալները միավորող ցանկացած հետազոտող ժառանգում է այդ անհամապատասխանությունը։

Կոնցենտրացիաների համատեքստը հասկանալու համար՝ 0.00005%-ը մոտ 1.56 միկրոմոլյար է, իսկ 0.0001%-ը՝ մոտ 3.13 միկրոմոլյար։ Սրանք փոքր թվեր են, և գայթակղիչ է դրանք համարել չափազանց ցածր՝ նշանակություն ունենալու համար։ Ստորև ներկայացված ուսումնասիրությունները ստուգում են հենց այդ ենթադրությունը՝ հենց այդ կոնցենտրացիաներում։

Այն ընթերցողները, որոնք գալիս են ձկների խնամքի, այլ ոչ թե լաբորատոր աշխատանքի ոլորտից, նույն մոլեկուլին հանդիպում են մեկ այլ միջավայրում, որը ներկայացված է մեթիլենային կապույտի ակվարիումային ուղեցույցում։ Քիմիան նույնն է․ բացատրությունը, թե ինչպես է ներկանյութը էլեկտրոններ տեղափոխում բջիջներում, օգնում է հասկանալ, թե ինչու է օքսիդավերականգնման ակտիվություն ունեցող միացությունը շարունակ հայտնվում նյութափոխանակության մասին հոդվածներում։ Ստորև ներկայացվածը վերաբերում է հատկապես զեբրադանիոյի ձկնկիթի՝ մեթիլենային կապույտ պարունակող ջրին։

Նյութափոխանակություն․ ազդեցության ուղղությունը փոխվում է զարգացման փուլին զուգահեռ

Առավել տեղեկատվական ուսումնասիրությունը բնականոն զարգացող զեբրադանիոներին ենթարկել է ազդեցության կյանքի առաջին օրվանից մինչև բեղմնավորումից հետո 5-րդ օրը և յուրաքանչյուր փուլում չափել օքսիդատիվ նյութափոխանակությունը, ինչպես նկարագրված է սաղմերի նյութափոխանակության փորձերի հրապարակված զեկույցում։ Այս օրինաչափությունը պետք է ներկայացնել ուշադիր, քանի որ դրա ուղղությունը շրջվում է։

Բեղմնավորումից հետո 1-ին օրը ազդեցության ենթարկված սաղմերի թթվածնի բազալ սպառումն աճել է խնամքի համար կիրառվող երկու կոնցենտրացիաներում էլ։ 2-րդ օրը թրթուրների մակերեսային շերտի միտոքոնդրիալ թաղանթի պոտենցիալը բարձրացել է 0.00005%, 0.0001% և 0.0003% կոնցենտրացիաներով ազդեցության դեպքում։ 4-ից 5-րդ օրերին՝ ձկնկիթից դուրս գալուց հետո, ազդեցության ուղղությունը շրջվել է․ օքսիդատիվ էներգածախսը նվազել է՝ անկախ նրանից, թե ազդեցությունը շարունակական է եղել բեղմնավորումից ի վեր, թե սուր՝ միայն 3-րդ օրից մինչև 4-րդ օրը։ Զուգահեռաբար, միտոքոնդրիալ շնչառական համալիրների ենթամիավորների տրանսկրիպտների քանակը նվազել է թե՛ 1-ին, թե՛ 4-րդ օրերին՝ ստերոիդագենեզի և գլյուկոնեոգենեզի հետ կապված տրանսկրիպտների հետ միասին։

Եվս երկու դիտարկում հստակեցնում են պատկերը։ Խնամքի համար կիրառվող ավելի բարձր կոնցենտրացիայի դեպքում ձկնկիթից դուրս գալը փոքր-ինչ վաղ է սկսվել․ 2-րդ օրը ազդեցության ենթարկված սաղմերն առաջ են անցել, իսկ վերահսկիչները նրանց հասել են մինչև 3-րդ օրը։ Բացի այդ, սթրեսային առանցքը, ըստ երևույթին, պահպանվել է անխաթար․ երբ 5-օրյա թրթուրներին ենթարկել են պտտվող շարժմամբ սթրեսորի ազդեցությանը, ամբողջ մարմնի կորտիզոլը երկու խմբերում էլ բնականոն բարձրացել է։ Այսպիսով, այս չափաբաժիններում ներկանյութը զարգացման ընդհանուր թույն չէ և չի ճնշում բոլոր ֆիզիոլոգիական արձագանքները։ Այն էներգետիկ նյութափոխանակությունը փոխում է զարգացման փուլից կախված՝ բարձրացնելով այն ձկնկիթից դուրս գալուց առաջ և նվազեցնելով դրանից հետո։

Վարք․ ինչու են երկու ուսումնասիրությունները տարբերվում, և ինչու երկուսն էլ կարող են ճիշտ լինել

Վարքի վերաբերյալ գրականությունը հակասական է թվում, մինչև ազդեցության սխեմաները կողք կողքի չեն համեմատվում։ Զարգացման և վարքային անվտանգության ուսումնասիրություններից մեկը սաղմերը բեղմնավորումից մոտ 6 ժամ հետո ենթարկել է մինչև 10 միկրոմոլյար կոնցենտրացիաների ազդեցությանը, լուծույթներն ամեն օր թարմացրել մինչև 4-րդ օրը, ապա 5-րդ և 6-րդ օրերի համար թրթուրներին տեղափոխել ներկանյութից զերծ միջավայր և 6-րդ օրը շարժողական ակտիվությունը ստուգել լույս-մութ փորձով։ Արդյունքը՝ մահացության, ձկնկիթից դուրս գալու կամ ձևաբանական նշանակալի փոփոխություններ չեն արձանագրվել, և մշակումը չի ազդել շարժողական ակտիվության վրա։ Հեղինակները հիմնավոր կերպով առաջարկել են 10 միկրոմոլյարը որպես վերին սահման իրենց պայմաններում։

Երկրորդ խումբը, որի հեղինակների մի մասը մասնակցել էր նաև նյութափոխանակության ուսումնասիրությանը, ազդեցությունը կազմակերպել է այնպես, ինչպես այն իրականում կիրառվում է խնամքի ժամանակ․ ներկանյութը ներկա է եղել բեղմնավորումից 2-ից 3 ժամ հետո՝ ամենօրյա մասնակի թարմացմամբ, իսկ վարքը չափվել է ընթացիկ կամ վերջերս ավարտված ազդեցության պայմաններում։ Նույն սովորական կոնցենտրացիաներում թրթուրները 24-ժամյա փորձարկման ընթացքում ցուցաբերել են շարժողական ակտիվության նվազում, որը վերարտադրվել է տարբեր գծերում և լաբորատորիաներում։ Վարքային արդյունքների շփոթեցման ուսումնասիրությունը ազդեցությունը կապել է սերոտոնիներգիկ տոնուսի հետ, ինչը համահունչ է ներկանյութի՝ մոնոամինօքսիդազն արգելակելու հայտնի հատկությանը։ Առավել խոսուն է այն, որ մեթիլենային կապույտ պարունակող սաղմային միջավայրը քողարկել է սերոտոնինի հետզավթման ընտրողական արգելակիչի՝ SSRI ֆլուօքսետինի նկատմամբ սպասվող շարժողական արձագանքը։ Հետևաբար կապույտ ջրում անցկացվող սկրինինգային փորձարկումը կարող է չնկատել դեղի այն ազդեցությունը, որը կբացահայտվեր թափանցիկ ջրում։

Իրական հակասություն չկա։ Միացությունը մի փորձարկման ժամանակ կարող է հեռացվելուց երկու օր անց ազդեցության հայտնաբերելի հետք չթողնել և միաժամանակ մեկ այլ փորձարկման ընթացքում ակտիվ մնալ, քանի դեռ առկա է։ Գործնական իմաստն այն է, որ ազդեցության բացակայությունը հիմնավորում է կոնցենտրացիայի վերին սահմանը, ոչ թե չեզոքության պնդումը, մինչդեռ հայտնաբերված ազդեցությունը նկարագրում է կարևոր ռիսկը․ ակտիվ ազդեցություն չափման ընթացքում՝ հենց այն պայմաններում, որոնք օգտագործում են լաբորատորիաների մեծ մասը։

Օքսիդավերականգնող ներկանյութը՝ օքսիդավերականգնման փորձարկման ներսում

Եվս մեկ թակարդ արժանի է առանձին պարբերության, քանի որ այն խաթարում է չափման մեթոդը, ոչ թե կենդանուն։ Էներգածախսի Alamar Blue փորձարկումն ինքնին օքսիդավերականգնման քիմիա է․ ռեզազուրինը վերականգնվում է ֆլուորեսցենտ ռեզորուֆինի։ Մեթիլենային կապույտը նույնպես օքսիդավերականգնման քիմիա է։ Առանց բջիջների վերահսկիչ նմուշներում խնամքի համար կիրառվող երկու կոնցենտրացիաներն էլ 24 ժամ անց փոքր-ինչ, բայց նշանակալիորեն նվազեցրել են Alamar Blue-ի ֆլուորեսցենցիան։ Կենդանիների փորձերում ազդեցության ենթարկված սաղմերը փորձարկումից առաջ առնվազն երեք անգամ լվացվել են ներկանյութից զերծ միջավայրում, իսկ ձկնկիթից դուրս եկած թրթուրների կենսաբանական ազդեցությունը գերազանցել է առանց բջիջների պայմաններում դիտված միջամտությունը։ Հետևաբար երկուսն էլ ճիշտ են․ լվացված կենդանիների մոտ պահպանվում է իրական նյութափոխանակային ազդեցություն, իսկ չհեռացված ներկանյութը դրան ավելացնում է ուղղակի քիմիական արտեֆակտ։ Վերահսկիչները պետք է տարանջատեն այդ երկուսը, այլապես ոչ մի թվային արդյունք իմաստ չի ունենա։ Ներկանյութերի վրա հիմնված փորձարկումների արդյունքների մեկնաբանման ընդհանուր ուղեցույցն այստեղ հատկապես կարևոր է։

Զարգացման փուլերի ժամանակագիծ

Այս հոդվածի համար ստեղծված բնօրինակ նյութը։ Եթե այլ բան նշված չէ, կոնցենտրացիաները խնամքի երկու ստանդարտ արժեքներն են՝ 0.00005% և 0.0001%։

Հիշելու հիմնական օրինաչափությունը նյութափոխանակային վերջնակետերի վաղ բարձրացումն ու ավելի ուշ նվազումն է։ Վարքային ազդեցություններն առկա են ազդեցության ընթացքում և չեն հայտնաբերվում ներկանյութից ազատման շրջանից հետո այն միակ փորձարկման մեջ, որտեղ դա ստուգվել է։

Վերահսկիչ խմբերի նախագծման ստուգացանկ

Երկրորդ բնօրինակ նյութը։ Օգտագործեք այն, երբ զեբրադանիոյի՝ մեթիլենային կապույտով խնամքի արձանագրությունները համադրվում են փորձի հետ։

1. Ներկանյութը ներկայացրեք որպես ռեագենտ, ոչ թե որպես ջուր։ Նշեք կոնցենտրացիան և՛ տոկոսով, և՛ միկրոմոլյարով, ազդեցության սկիզբն ու ավարտը՝ բեղմնավորումից հետո ժամերով կամ օրերով, թարմացման ժամանակացույցը և յուրաքանչյուր չափումից առաջ ներկանյութի հեռացման ժամանակահատվածը։
2. Վերահսկիչ խմբերը համապատասխանեցրեք հարցին։ Փորձարկվող քիմիական նյութի ուսումնասիրությանը պետք են ներկանյութից զերծ վերահսկիչներ, իսկ խնամքի ուսումնասիրությանը՝ ներկանյութից զերծ և ներկանյութով խմբեր՝ հակասնկային արդյունքի գրանցմամբ, քանի որ վկայակոչված ուսումնասիրություններից ոչ մեկը չի չափել հակասնկային արդյունավետությունը։
3. Օքսիդավերականգնման փորձարկումներից առաջ լվացեք, ապա ստուգեք։ Առնվազն երեք անգամ ողողեք ներկանյութից զերծ միջավայրում և զուգահեռ օգտագործեք առանց բջիջների՝ ներկանյութ ու ռեագենտ պարունակող վերահսկիչ նմուշ, քանի որ ներկանյութն ուղղակիորեն նվազեցնում է Alamar Blue-ի ազդանշանը։
4. Վարքային և մոնոամինային վերջնակետերը համարեք բարձր ռիսկային։ Շարժողական ակտիվության, հանկարծակի գրգռիչին արձագանքի, անհանգստանման վարքի, հակադեպրեսանտների և MAO արգելակիչների ուսումնասիրությունները պետք է չափման ընթացքում խուսափեն ներկանյութից կամ ապացուցեն դրա չեզոքությունը տվյալ վերջնակետի նկատմամբ։ Մեկից երկու օրվա հեռացման շրջանը վերացրել է մեկ շարժողական ազդեցություն, բայց դա այլ փորձարարական սխեմաների համար ապացուցված չէ։
5. Նյութափոխանակային և միտոքոնդրիալ վերջնակետերը բոլոր փուլերում համարեք բարձր ռիսկային։ Թթվածնի սպառումը, էներգածախսը, թաղանթային պոտենցիալը և շնչառական շղթայի տրանսկրիպտները փոփոխվում են խնամքի համար կիրառվող կոնցենտրացիաներում՝ հակառակ ուղղություններով ձկնկիթից դուրս գալուց առաջ և հետո։
6. Մի տարածեք չեզոքության եզրակացությունը տարբեր փորձարարական սխեմաների վրա։ Ներկանյութի հեռացումից հետո ազդեցության բացակայությունը չի վերաբերում շարունակվող ազդեցությանը, ձևաբանական ազդեցության բացակայությունը չի վերաբերում նյութափոխանակությանը կամ դեղի հետ փոխազդեցությանը, իսկ մեկ գծի, ջերմաստիճանի կամ փորձարկման տևողության պայմաններում ստացված արդյունքը չի վերաբերում մյուսներին։
7. Նշեք այն ուղեցույցը, որին հետևել եք, և դրա այլընտրանքը։ Հստակ նշեք CCAC-ի, եվրոպական կամ Cold Spring Harbor-ի կոնցենտրացիաները և մատնանշեք, որ OECD-ի սաղմային փորձարկումը ներկանյութ չի նախատեսում, որպեսզի ընթերցողը կարողանա հասկանալ ձեր կենդանիների պահման պայմանները։

Սրանցից ոչ մեկը չի հակադրվում ձկնկիթը կենդանի պահելու համար ներկանյութի օգտագործմանը։ Դրանք հակադրվում են խնամքի ընտրությունն առանց ստուգման տվյալների մեջ տեղափոխելուն։ Տարայի կապույտը դեղաբանական հատկություններ ունեցող մոլեկուլ է, իսկ աղավաղման առավել մեծ հավանականություն ունեցող փորձերը հենց բարձր թողունակությամբ նյութափոխանակային և նյարդավարքային սկրինինգներն են, որոնց համար այժմ նախընտրում են երիտասարդ զեբրադանիոներին։ Արձանագրեք այն, վերահսկեք այն, հեռացրեք այն չափումից առաջ և ստուգեք այն փորձարկումը, որին այն կարող է աննկատ մասնակցել։