Մեթիլենային կապույտով խմորասնկերի փորձեր․ կենդանի բջիջների հաշվարկն ընդդեմ շնչառության ժամանակաչափման

Լաբորատոր սեղանին երկու փորձանոթ կա։ Երկուսն էլ կապույտ են։ Մեկում մանրադիտակի տակ երևացող կապույտ բջիջները նշանակում են մահացած խմորասնկեր։ Մյուսում կապույտից անգույն դարձող փորձանոթը նշանակում է, որ խմորասնկերը կենդանի են և շնչում են։ Նույն ներկանյութը, հակառակ մեկնաբանություններ։ Շփոթեք այս երկու փորձերը, և բոլոր եզրակացությունները կշրջվեն։

Ամբողջ հոդվածը հենց այս տարբերության մասին է։ Մեթիլենային կապույտը օքսիդավերականգնման ներկանյութ է․ օքսիդացված վիճակում այն կապույտ է, իսկ վերականգնված վիճակում՝ անգույն լեյկոմեթիլենային կապույտ։ Կենսունակության հաշվարկն այս քիմիական հատկությունն օգտագործում է կարճատև մանրադիտակային դիտարկման մեջ։ Շնչառության փորձն այն օգտագործում է ամբողջ խառնուրդում ընթացող ռեակցիայի ժամանակաչափման համար։ Յուրաքանչյուրին անհրաժեշտ են սեփական արձանագրությունը, սեփական ստուգիչ նմուշները և սեփական քննադատական մոտեցումը։

Կենսունակության հաշվարկ․ կարճատև ներկում, անհապաղ գնահատում

Գարեջրագործական արձանագրությունն ամենաստանդարտացված տարբերակն է։ Պատրաստեք 0.01% w/v մեթիլենային կապույտ՝ 2% նատրիումի ցիտրատի լուծույթում, այն 1:1 հարաբերությամբ խառնեք խմորասնկերի սուսպենզիային և խառնուրդը հետազոտեք կարճ, հաստատուն ժամանակամիջոցից հետո։ Հրապարակված ժամանակամիջոցները տատանվում են Գարեջրագործության գիտական ինստիտուտի ձեռնարկում նշված 1-ից 2 րոպեից մինչև հետազոտական արձանագրություններում նշված մոտ 5 րոպեն, իսկ OIV-ի գինու մանրէաբանության մեթոդը պահանջում է հետազոտել 10 րոպեի ընթացքում։ Հաշվարկի համար նախատեսված խառնուրդում ներկանյութի վերջնական խտությունը մոտ 0.005% է։ Լցրեք բարելավված Neubauer հաշվիչ խցիկը և մոտ 400x խոշորացմամբ մուգ կապույտ բջիջները դասակարգեք որպես ոչ կենսունակ, իսկ չներկվածները՝ որպես կենսունակ։ OIV-ի մեթոդում բաց կապույտ բջիջները համարվում են կենդանի, ինչն արդեն հուշում է ստորև քննարկվող սուբյեկտիվության խնդրի մասին։

Բջիջների խտությունը հաշվարկվում է խցիկի երկրաչափությունից։ Երբ հաշվվում է ամբողջ կենտրոնական 1 mm քառակուսին, մեկ mL-ում բջիջների թիվը հավասար է N-ին՝ բազմապատկած նոսրացման գործակցով և 10^4-ով, որտեղ N-ն այդ մակերեսում հաշվված բջիջների թիվն է, ինչպես նկարագրված է ASBC-ի խմորասնկերի մեթոդներում։ Կենսունակության հաշվարկն ավելի պարզ է․ չներկված բջիջների թիվը բաժանվում է բջիջների ընդհանուր թվին և բազմապատկվում 100-ով։ Կենսունակությունը գնահատելու համար հաշվեք մոտ 400 բջիջ՝ հետևելով FEMS-ի գարեջրագործական համեմատական ուսումնասիրությանը և OIV-ի գործելակերպին։ Հետևողականորեն կիրառեք սահմանային բջիջների հաշվարկի մեկ կանոն, օրինակ՝ ներառեք ցանցի ստորին և ձախ գծերի վրա գտնվող բջիջները և բացառեք վերին ու աջ գծերի վրա գտնվողները։

Բողբոջների հաշվարկի կանոնը պետք է սահմանել նախքան հաշվարկը սկսելը։ Տարածված մոտեցմամբ բողբոջը հաշվվում է որպես առանձին բջիջ, երբ հասնում է մայր բջջի չափի մոտ կեսին, իսկ դրանից փոքր լինելու դեպքում՝ մայր բջջի հետ միասին։ Ինչ կանոն էլ ընտրեք, կիրառեք այն յուրաքանչյուր քառակուսու համար և գրանցեք աշխատանքային թերթիկում, որպեսզի հաջորդ աշխատակիցը կրկնի նույնը։

Հաշվարկի աշխատանքային թերթիկ (տպեք սա)

Այս աշխատանքային թերթիկը հատուկ այս հոդվածի համար ստեղծված նյութ է։ Արտագրեք այն նոթատետրում կամ տպեք մեկ օրինակ յուրաքանչյուր նմուշի համար։

Կենսունակություն (%) = 100 x չներկված / (չներկված + մուգ կապույտ)։ Բջիջների ընդհանուր թիվը մեկ mL-ում = N x նոսրացման գործակից x 10^4, որտեղ N-ը վերցվում է խցիկի սահմանված մակերեսից։ Արդյունքի կողքին գրանցեք ներկման ժամանակամիջոցը, քանի որ կենսունակության թիվն առանց իր ժամանակային տվյալների վերարտադրելի չէ։

Ինչու են կենսունակության թվերը տատանվում

Առաջին խանգարող գործոնը ժամանակն է, և այն ազդում է երկու ուղղությամբ։ Նյութափոխանակորեն ակտիվ բջիջները վերականգնում են ներկանյութը, ուստի վաղ գնահատման պահին կենդանի բջիջները կարող են դեռ չավարտած լինել դրա վերականգնումը և սխալմամբ դասակարգվել որպես մահացած։ Բայց երկարատև ազդեցությունն ինքնին թունավոր է և առաջացնում է իսկապես վնասված կապույտ բջիջներ՝ ստեղծելով մահվան կեղծ ցուցիչ հանդիսացող ներկում։ Այդ պատճառով լաբորատոր ուսուցման արձանագրությունը սահմանում է գնահատումը կատարել 5 րոպեի ընթացքում, ինչպես փաստագրված է Վիսկոնսինի խմորասնկերի ուսուցման արձանագրությունում։ Հիմնավորված ձևակերպումն այն է, որ մեթիլենային կապույտով գնահատումը կախված է ժամանակից, ուստի սահմանեք մեկ կարճ ժամանակամիջոց և այն անփոփոխ պահեք շարքի բոլոր նմուշների համար։

Ցածր կենսունակությամբ նմուշների դեպքում առկա է երկրորդ շեղումը։ Ստանդարտացված մեթոդը զգուշացնում է, որ մոտ 80%-ից ցածր կենսունակության դեպքում մեթիլենային կապույտը կարող է գերագնահատել իրական կենսունակությունը, քանի որ ներկանյութը դեռ վերականգնող բջիջները պարտադիր չէ, որ պահպանած լինեն վերարտադրվելու կարողությունը։ Գարեջրագործական գրականությունը նկարագրում է նույն անվստահելիությունը, երբ կենսունակությունը զգալիորեն նվազած է։ Մեթիլենային կապույտը դիտարկեք որպես արագ, մոտավոր գնահատման միջոց, իսկ ցածր կենսունակության հետ կապված կարևոր որոշումները, օրինակ՝ մշակույթը կրկին խմորման մեջ ներմուծելը, հաստատեք ագարային թիթեղների վրա հաշվարկներով կամ լրացուցիչ ներկանյութով։

Երրորդը նմուշի միջավայրի ազդեցություններն են։ OIV-ի մեթոդն իրականացվում է մոտ pH 4.6-ում և զգուշացնում է, որ ցածր pH-ով, ուժեղ բուֆերացված նմուշները խանգարում են ներկանյութի ճիշտ վարքին։ Այն նաև խորհուրդ չի տալիս փորձը կատարել 100 g/L-ից բարձր շաքարի պարունակության դեպքում, երբ բջիջները մոլորեցնող բաց կապույտ են երևում։ Ներկման pH-ի փորձարարական համեմատությունը հետազոտված միջակայքում հայտնաբերել է զգայունության զգալի փոփոխություններ, ինչը համահունչ է մեթիլենային կապույտի մեթոդի pH-ից կախվածության ուսումնասիրությանը։ Մնացորդային մասնիկներն առանձին թակարդ են․ աղտոտված խյուսերում ներկված մասնիկները նմանվում են մահացած բջիջների և մեծացնում տարբեր աշխատակիցների արդյունքների տարբերությունը։

Այդ տարբերությունը քանակապես չափված է, ոչ թե պարզապես առանձին դիտարկում։ FEMS-ի խմորասնկերի համեմատական ուսումնասիրությունում ներկայացված՝ գարեջրագործարանում անցկացված վեցամսյա փորձի ընթացքում մեթիլենային կապույտով կրկնակի չափումների ստանդարտ շեղումը միջինում 6.1% էր՝ օքսոնոլով հոսքային ցիտոմետրիայի 0.2%-ի դիմաց, իսկ երկու աշխատակիցների արդյունքները նույն նմուշի համար տարբերվում էին մինչև 13 տոկոսային կետով։ Կենսունակության մեթոդների 2023 թվականի քանակական համեմատությունը պարզել է, որ ֆլուորեսցենտային մանրադիտակումը և հոսքային ցիտոմետրիան զգալիորեն ավելի ճշգրիտ են՝ միաժամանակ ցույց տալով, որ մեթոդների արդյունավետությունը կախված է տեսակից և նմուշի միջավայրից։ Painting-ի և Kirsop-ի մեթոդի դասական նկարագրությունը (PMID 24430080) շարունակում է մնալ ելակետային հղումը, իսկ խմորասնկերի կենսունակության և կենսագործունեության փորձերի ավելի լայն ակնարկը (PMID 25154541) մեթիլենային կապույտը դասում է լրացուցիչ, ոչ թե վերջնական գնահատում տվող փորձերի շարքին։ Տրիպանային կապույտն այստեղ ինքնաբերաբար ավելի լավ տարբերակ չէ․ այն ցույց է տալիս թաղանթի ամբողջականության կորուստը, մինչդեռ մեթիլենային կապույտը ցույց է տալիս ներկանյութի կլանումն ու վերականգնող ակտիվությունը, ուստի սթրեսի ենթարկված բջիջները կարող են այս երկու ներկանյութերով տարբեր կերպ դասակարգվել։

Շնչառության փորձ․ չափեք կապույտի անհետացման ժամանակը

Երկրորդ փորձում մանրադիտակ ընդհանրապես չի օգտագործվում։ Խմորասնկերը, գլյուկոզը և նոսր մեթիլենային կապույտը լցվում են փակ փորձանոթի մեջ, և ժամաչափով չափվում է կապույտի անհետացման ժամանակը։ Նյութափոխանակության ընթացքում բջիջները առաջացնում են վերականգնող համարժեքներ, որոնք կապույտ ներկանյութը փոխակերպում են դրա անգույն ձևի, մինչդեռ լուծված թթվածինը կրկին օքսիդացնում է այն։ Երբ բջիջները նվազեցնում են թթվածնի քանակը, ընդհանուր գործընթացում վերականգնումը գերակշռում է, և փորձանոթը գունազրկվում է։ Հետևաբար վերջնակետն արտացոլում է շնչառության, ներկանյութի խտության և թթվածնի հասանելիության հավասարակշռությունը, և այն պետք է ներկայացվի որպես մեթիլենային կապույտի վերականգնման կամ գունազրկման ժամանակ, ոչ թե որպես մոլեկուլային թթվածնի սպառման ուղղակի արագություն։

Օգտագործեք կենսունակության հետազոտություններից շատ ավելի նոսր ներկանյութ, որպեսզի չափվող ժամանակը տեղավորվի հարմար միջակայքում։ AQA-ի A մակարդակի պարտադիր գործնական աշխատանքների ձեռնարկը սա լավ է ստանդարտացնում․ 1 g գլյուկոզ՝ մոտ 30 C տաքացված 100 mL ջրում, օգտագործումից անմիջապես առաջ ավելացված 5 g չոր խմորասնկեր և մոտ 0.001% աշխատանքային ներկանյութ, որը պատրաստվում է 1% ելային լուծույթի 0.1 mL-ը մինչև 100 mL նոսրացնելով։ Խառնեք խմորասնկեր-գլյուկոզ սուսպենզիայի 2 mL-ը աշխատանքային ներկանյութի 2 mL-ի հետ, թողեք, որ խառնուրդը հասնի փորձի ջերմաստիճանին, մեկ անգամ թափահարեք 10 վայրկյան, միացրեք ժամաչափը և այլևս մի թափահարեք։ Թափահարումը նորից թթվածին է ներմուծում և փորձանոթը կրկին կապույտ դարձնում, ինչը ընթացակարգով պայմանավորված ամենամեծ արտեֆակտն է։ AQA-ն նշում է, որ պատրաստուկը սովորաբար պետք է գունազրկվի մոտ 5 րոպեի ընթացքում՝ 35 C-ում, իսկ փորձերի միջին արժեքները կազմել են 275 s՝ 20 C-ում, 128 s՝ 35 C-ում և 145 s՝ 45 C-ում։ Դրանք մեկ փորձակարգից վերցված օրինակներ են, ոչ թե համընդհանուր չափանիշներ։ Վերահսկվող պայմաններում վերականգնման արագության և նյութափոխանակորեն ակտիվ խմորասնկերի միջև քանակական կապը հաստատվում է վերականգնման հատուկ ուսումնասիրություններով, այդ թվում՝ PMID 25773544 համարով գրանցված աշխատանքով և Yeast-ում (2014) հրապարակված մեխանիզմների ուսումնասիրությամբ։

Ժամանակային ընթացքի ցուցադրում (հեղինակային նյութ)

Ստորև բերված աղյուսակը հատուկ այս հոդվածի համար ստեղծված ցուցադրական նյութ է՝ հիմնված վերը նկարագրված AQA-ի տիպի փորձակարգի վրա․ 2 mL խմորասնկեր-գլյուկոզ խառնուրդ և մոտ 0.001% աշխատանքային ներկանյութի 2 mL, մեկ 10 վայրկյանանոց թափահարում, ապա ինկուբացում առանց խառնուրդը շարժելու։ Տվյալները օրինակային ցուցմունքներ են այն ձևաչափով, որով պետք է գրանցի ուսանողների խումբը, իսկ արագության ցուցիչը սահմանվում է որպես 1՝ բաժանած վայրկյաններով արտահայտված գունազրկման ժամանակին։ Կատարեք փորձը նույն փորձանոթներով և այս գրառումները փոխարինեք չափված արժեքներով։

A, B և C փորձանոթների համար կառուցեք արագության ցուցիչի՝ ջերմաստիճանից կախվածության գրաֆիկը։ Կորը բարձրանում է, ապա հարթվում կամ իջնում, ինչը ֆերմենտներով պայմանավորված սպասվող օրինաչափությունն է, ոչ թե ուղիղ գիծ։ D, E և F փորձանոթները այդ կորի տվյալների կետերը չեն։ Դրանք ստուգիչ նմուշներն են, որոնք թույլ են տալիս մեկնաբանել կորը։

Ստուգիչ նմուշներ, որոնք իմաստ են տալիս յուրաքանչյուր փորձին

Շնչառության յուրաքանչյուր փորձին պետք է ուղեկցեն երեք ստուգիչ նմուշներ։ Եռացրած կամ ոչնչացված խմորասնկերը՝ գլյուկոզի և ներկանյութի հետ, պետք է մնան կապույտ՝ հաստատելով, որ արագ վերականգնումը կախված է կենդանի բջիջների նյութափոխանակությունից։ Կենդանի խմորասնկերը ներկանյութի հետ, առանց ավելացված գլյուկոզի, սուբստրատի ստուգիչ նմուշն են, բայց միևնույն է սպասեք դանդաղ գունազրկման, քանի որ խմորասնկերն օգտագործում են իրենց ներքին պաշարները։ Գլյուկոզը ներկանյութի հետ, առանց խմորասնկերի, քիմիական դատարկ նմուշն է․ այն անհրաժեշտ է, քանի որ ալկալային միջավայրում գլյուկոզը կարող է վերականգնել մեթիլենային կապույտը՝ առանց որևէ բջջի առկայության։

Կենսունակության հաշվարկին անհրաժեշտ է այլ տեսակի վերահսկում՝ ընթացակարգի անփոփոխություն։ Նույն ներկանյութի ելային լուծույթը, նույն խառնման հարաբերությունը, նույն ներկման ժամանակամիջոցը, նույն խցիկի մակերեսը, նույն բողբոջների և սահմանային բջիջների հաշվարկի կանոնները, իսկ հնարավորության դեպքում՝ կույր հաշվարկ։ Երբ երկու աշխատակիցների արդյունքները տարբերվում են տասը տոկոսային կետով, աշխատանքային թերթիկը սովորաբար բացահայտում է պատճառը՝ տարբեր ժամանակամիջոց, կապույտի տարբեր շեմ կամ բողբոջների հաշվարկի տարբեր կանոններ։ Ներկված բջիջների պատրաստման և դիտման տեխնիկաները կապված են մանրէների պարզ ներկման մեթոդների հետ, իսկ տարբեր նմուշներում ներկանյութի նշած կառուցվածքների ավելի լայն նկարագրությունը ներկայացված է մանրադիտակային ներկման ատլասում։ Կապույտի ցանկացած ինտենսիվության քանակական գնահատման ֆիզիկական հիմքերի համար պայմաններով պիտակավորված կլանման տեղեկատուն բացատրում է, թե ինչու յուրաքանչյուր գործակից պետք է ուղեկցվի իր լուծիչի, pH-ի և խտության պայմաններով։

Փորձն ընտրեք ըստ հարցի։ Քանի բջիջ է կենդանի հենց հիմա՝ հաշվարկի հարց է, որին պատասխանում են մանրադիտակով և աշխատանքային թերթիկով։ Որքան ակտիվ է շնչում այս մշակույթը՝ կինետիկ հարց է, որին պատասխանում են վայրկենաչափով և վերահսկվող փորձանոթներով։ Մեթիլենային կապույտը ծառայում է երկուսին էլ, բայց երբեք նույն փորձանոթում՝ միաժամանակ։