Մեթիլենային կապույտը և բորբոքային ազդանշանումը․ ինֆլամասոմներ, IL-6 և STAT3

Ենթադրենք՝ երեք լաբորատորիա հայտնում են, որ նույն կապույտ միացությունն ունի հակաբորբոքային ազդեցություն։ Մեկը ցույց է տալիս մակրոֆագներից IL-1beta-ի ավելի քիչ արտազատում։ Մյուսը՝ նույն բջջատեսակում iNOS ֆերմենտի ավելի փոքր քանակ։ Երրորդը՝ արյան մեջ IL-6-ի ավելի ցածր մակարդակ և ուղեղում STAT3-ի ավելի թույլ ակտիվություն։ Գայթակղիչ է երեք արդյունքը միավորել մեկ պնդման մեջ։ Սակայն այդ միավորումը քողարկում է բացահայտումը։

Յուրաքանչյուր արդյունք վերաբերում է ազդանշանման տարբեր մեխանիզմի՝ իր գործարկիչով, հավաքման փուլով և չափվող ցուցանիշով։ Մեթիլենային կապույտը յուրաքանչյուր մեխանիզմի վրա ազդում է տարբեր կետում։ Արդյոք դրանցից որևէ մեկը բարելավում է առողջական արդյունքը՝ առանձին հարց է, որը քննարկվում է մեթիլենային կապույտի և բորբոքման մասին մեր ակնարկում։ Այս էջը կենտրոնանում է ազդանշանային ուղիների վրա։

Ուղի 1․ ինֆլամասոմի հավաքում և caspase-1

Ինֆլամասոմը սպիտակուցային հենք է, որը միելոիդ բջջի ներսում կառուցվում է ըստ անհրաժեշտության։ Դրա բաղադրիչներն են սենսորը, ASC կոչվող ադապտորը և caspase-1 կոչվող էֆեկտոր ֆերմենտը։ Հավաքումից հետո caspase-1-ը ճեղքում է pro-IL-1beta-ն և pro-IL-18-ը՝ վերածելով դրանց արտազատվող ձևերի, և կարող է գործարկել պիրոպտոզ՝ բջջամահի բորբոքային ձև։ Տեսակը որոշում է սենսորը․ NLRP3-ը արձագանքում է բյուրեղներին և ծակոտիներ առաջացնող տոքսիններին, օրինակ՝ նիգերիցինին և ATP-ին, NLRC4-ը՝ բակտերիալ ֆլագելինին, AIM2-ը՝ ցիտոզոլային երկշղթա ԴՆԹ-ին, իսկ ոչ կանոնական ուղին՝ ներբջջային լիպոպոլիսախարիդին։

Ակտիվացման համար անհրաժեշտ է երկու ազդանշան։ Առաջին ազդանշանը նախապատրաստումն է․ Toll-նման ընկալիչի լիգանդը խթանում է NLRP3-ի և pro-IL-1beta-ի՝ NF-kB-ից կախված տրանսկրիպցիան, որպեսզի անհրաժեշտ բաղադրիչները առկա լինեն։ Երկրորդ ազդանշանը հավաքումն է․ երկրորդ գործարկիչը հանգեցնում է ASC-ի օլիգոմերացմանը՝ կետային կուտակումների ձևավորմամբ, caspase-1-ի ճեղքմանը՝ p20 հատվածի առաջացմամբ, և հասուն IL-1beta p17-ի արտազատմանը։ Հայտնի է, որ միտոքոնդրիալ թթվածնի ակտիվ ձևերը և բյուրեղների կլանումը նպաստում են NLRP3-ի երկրորդ ազդանշանին։

Ինֆլամասոմների լայն ընդգրկմամբ արգելակման՝ մակրոֆագների վրա կատարված 2017 թվականի ուսումնասիրությունը ստուգել է մեթիլենային կապույտը երկու ազդանշանների փուլերում էլ։ Լիպոպոլիսախարիդով նախապատրաստված մկան ոսկրածուծային մակրոֆագներում նիգերիցինը, ATP-ն և նատրիումի մոնոուրատի բյուրեղները յուրաքանչյուրն առաջացրել են IL-1beta-ի և caspase-1-ի արտազատում, ինչպես նաև ASC-ի կետային կուտակումների ձևավորում։ 20-ից 200 micromolar մեթիլենային կապույտը նվազեցրել է երեքն էլ՝ դոզայից կախված ձևով, առանց բջիջները սպանելու։ Նույն պատկերը դիտվել է NLRC4-ի համար կիրառված ֆլագելինի և Salmonella-ի, AIM2-ի համար կիրառված երկշղթա ԴՆԹ-ի և Listeria-ի, ինչպես նաև ոչ կանոնական ուղու համար կիրառված տրանսֆեկցված լիպոպոլիսախարիդի կամ կենդանի E. coli-ի դեպքում։ Միացությունն ինքնին արտազատում չի գործարկել, իսկ վերահսկիչ թիթեղներում հակաբակտերիալ ազդեցություն չի հայտնաբերվել, ուստի արդյունքը վերաբերում է հյուրընկալող օրգանիզմի արձագանքին։

Ուղու ավելի վաղ փուլերում չափվել են ազդեցության երեք կետեր։ Ռոտենոնով առաջացած միտոքոնդրիալ սուպերօքսիդը նվազել է մեթիլենային կապույտի ազդեցությամբ, և դրա հետ նվազել է նաև ռոտենոնով խթանված IL-1beta-ի արտազատումը։ Նվազել է ֆլուորեսցենտ հատիկների կլանումը, ինչը համահունչ է բյուրեղների ճանաչմանը նախորդող ֆագոցիտոզի նվազմանը։ NF-kB-ի երկու տեղամաս պարունակող NLRP3 պրոմոտորով կառավարվող ռեպորտերը մեթիլենային կապույտի ներկայությամբ ցույց է տվել ավելի ցածր ակտիվություն, մինչդեռ այդ տեղամասերից զուրկ կրճատված պրոմոտորը չի արձագանքել։ Առանց բջիջների փորձանոթում մեթիլենային կապույտը նաև ուղղակիորեն նվազեցրել է մարդու ռեկոմբինանտ caspase-1-ի ակտիվությունը։ Միացության ավելացումը միայն նախապատրաստման կամ միայն ակտիվացման փուլում նույնպես նվազեցրել է IL-1beta-ի, IL-18-ի և caspase-1-ի արտազատումը, ուստի ներգրավված են երկու փուլերն էլ։

Մկների վրա փորձերը համապատասխանել են այս ընտրողականությանը։ Լիպոպոլիսախարիդի մահացու դոզան վերահսկիչ խմբի մկներին սպանել է ժամերի ընթացքում, մինչդեռ մեթիլենային կապույտը բարձրացրել է գոյատևումը․ որովայնամզային հեղուկում IL-1beta-ն նվազել է, սակայն նույն հեղուկում IL-6-ը չի նվազել։ Listeria-ով առաջացված պերիտոնիտի մոդելում որովայնամզային հեղուկի IL-1beta-ն նվազել է, մինչդեռ բջիջների ընդհանուր քանակը մնացել է անփոփոխ։ Մարդու THP-1 մոնոցիտները ինֆլամասոմների բոլոր չորս տեսակների դեպքում արձագանքել են մկան մակրոֆագների նման։ Ինֆլամասոմին վերաբերող արդյունքը բացատրում է IL-1beta-ի և IL-18-ի հասունացումը, ոչ թե յուրաքանչյուր ցիտոկինի փոփոխությունը։ Նույն պատճառով միկրոգլիայի և աստրոցիտների փորձերում ուղեղի իմունային բջիջների ձևը պատասխանում է այլ հարցի, քան հենքի հավաքումը։

Ուղի 2․ iNOS-ի տրանսկրիպցիա՝ NF-kB-ի և STAT1-ի կապման միջոցով

Ինդուցվող ազոտի մոնօքսիդի սինթազը՝ iNOS-ը, հանգստի վիճակում գրեթե բացակայում է և տրանսկրիպցիայի է ենթարկվում ըստ անհրաժեշտության։ Լիպոպոլիսախարիդը դա խթանում է հիմնականում IkB-alpha-ի քայքայման միջոցով, որին հաջորդում են NF-kB-ի ֆոսֆորիլացումը և մուտքը կորիզ։ Ինտերֆերոն-գամման դա խթանում է հիմնականում Յանուս կինազի կողմից STAT1-ի ֆոսֆորիլացման միջոցով, որին հաջորդում է STAT1-ի մուտքը կորիզ։ Այնուհետև յուրաքանչյուր գործոն կապվում է iNOS-ի պրոմոտորի իր տեղամասին։ Ֆերմենտի ակտիվությունն ու գենի ինդուկցիան վերահսկման առանձին կետեր են, և դեղը կարող է ազդել դրանցից մեկի կամ երկուսի վրա։

Մակրոֆագներում և էնդոտոքսեմիկ մկներում iNOS-ի ինդուկցիայի 2015 թվականի ուսումնասիրությունը ազդեցությունը տեղորոշել է տեղեկատվական ՌՆԹ-ի մակարդակում։ RAW 264.7 բջիջներում և մկան առաջնային մակրոֆագներում լիպոպոլիսախարիդից, ինտերֆերոն-գամմայից կամ երկուսից 30 րոպե առաջ տրված 1 micromolar մեթիլենային կապույտը 8-ից 24 ժամվա ընթացքում նվազեցրել է iNOS սպիտակուցի և mRNA-ի քանակը։ Սննդամիջավայրում նիտրիտը նույնպես նվազել է՝ առանց կենսունակության կորստի։ 25 mg per kg լիպոպոլիսախարիդ ստացած մկներում մեկ ժամ ավելի վաղ տրված 5 mg per kg միանվագ դոզան նվազեցրել է iNOS սպիտակուցի և mRNA-ի քանակը թոքերում, լյարդում և սրտում։

Հատկանշականն այն է, թե ինչ չի փոխվել։ IkB-alpha-ի քայքայումը, NF-kB-ի ֆոսֆորիլացումը, STAT1-ի ֆոսֆորիլացումը և երկու գործոններից յուրաքանչյուրի կուտակումը կորիզում մնացել են անփոփոխ։ Խանգարումը տեղի է ունեցել մեկ քայլ ավելի ուշ․ կորիզային քաղվածքները ցույց են տվել լիպոպոլիսախարիդից հետո NF-kB-ի ավելի թույլ կապում իր ԴՆԹ տարրին և ինտերֆերոն-գամմայից հետո STAT1-ի ավելի թույլ կապում։ Քրոմատինի իմունոպրեցիպիտացիան հաստատել է, որ բջիջների ներսում երկու գործոններից յուրաքանչյուրն ավելի քիչ է զբաղեցրել iNOS-ի պրոմոտորը։ Նվազել է նաև ուռուցքի նեկրոզի գործոն ալֆան, որի պրոմոտորը նույնպես օգտագործում է NF-kB-ը։ Գործոններն ակտիվացել էին և հասել կորիզ, բայց թույլ էին կապվում իրենց թիրախային ԴՆԹ-ին։

Ուշադրություն դարձրեք 1-ին ուղու հետ տարբերությանը։ Սա վերաբերում է գործոնի՝ ԴՆԹ-ի հետ կապմանը, ներառում է STAT1-ը, ոչ թե STAT3-ը, և որպես ցուցանիշներ օգտագործում է mRNA-ն, սպիտակուցը և նիտրիտը, ոչ թե ASC-ի կետային կուտակումներն ու caspase-1-ի հատվածները։ Բջջային մոդելներում մեթիլենային կապույտի թիրախների մեր քարտեզը տրանսկրիպցիոն այս մակարդակը տարանջատում է ֆերմենտների և միտոքոնդրիալ ցուցանիշների ուղղակի չափումներից։

Ուղի 3․ շիճուկային IL-6 և հյուսվածքային STAT3-ի ակտիվացում

IL-6-ը gp130 ընկալիչների ընտանիքի միջոցով ազդանշանը փոխանցում է Յանուս կինազից STAT3 կասկադին։ Ֆոսֆորիլացված STAT3-ը դիմերանում է, մտնում կորիզ և գործարկում բորբոքային ծրագրեր, մինչդեռ IL-6-ն ինքնին NF-kB-ի թիրախ է։ Այսպիսով, դրանք կազմում են հետադարձ կապի օղակ, որը հաճախ կոչվում է IL-6-ից STAT3 առանցք։ Ստանդարտ չափվող ցուցանիշներն են ուղու սկզբնամասի շիճուկային IL-6-ը, ֆոսֆորիլացված STAT3-ի հարաբերությունը ընդհանուր STAT3-ին և ուղու հաջորդ փուլերի էֆեկտոր ֆերմենտները, օրինակ՝ iNOS-ը և COX2-ը։

Լիպոպոլիսախարիդից հետո IL-6-ի և STAT3-ի վերաբերյալ մկների վրա կատարված 2023 թվականի ուսումնասիրությունը այս առանցքը չափել է տարբեր միջավայրերում։ Արու C57BL/6 մկները երեք օր շարունակ օրական ստացել են 1 mg per kg լիպոպոլիսախարիդ, իսկ յուրաքանչյուր դոզայից 30 րոպե հետո՝ 5 կամ 10 mg per kg մեթիլենային կապույտ։ Երրորդ օրը շիճուկային IL-6-ը մեթիլենային կապույտ ստացած երկու խմբերում էլ ավելի ցածր էր, քան միայն լիպոպոլիսախարիդ ստացած խմբում, մինչդեռ հետազոտված մյուս ցիտոկինների մեծ մասը միջամտության ազդեցությամբ չէր փոխվել։ Ֆոսֆորիլացված STAT3-ի հարաբերությունն ընդհանուր STAT3-ին ավելի ցածր էր ուղեղի կեղևում, հիպոկամպում և ականջի մաշկում։ Միաժամանակ դիտվել են միկրոգլիայի ավելի թույլ Iba-1 ներկում, iNOS-ի և COX2-ի ավելի ցածր մակարդակներ և քաշի կորստի մասնակի մեղմացում։

Այստեղ անհրաժեշտ է երկու վերապահում։ Շիճուկային IL-6-ի նվազումը՝ հյուսվածքային STAT3-ի ֆոսֆորիլացման նվազման հետ միասին, համահունչ է առանցքի մոդուլացմանը, բայց չի բացահայտում առաջնային հանգույցը։ Նույն հարաբերությունը կարող է առաջանալ թե՛ ուղու սկզբնամասում ցիտոկինի նվազումից, թե՛ ընկալիչային ազդանշանման նվազումից, թե՛ ֆոսֆատազի ակտիվության փոփոխությունից։ Բացի այդ, սուր ազդեցության երեք օրերի ընթացքում քաշը ամբողջ կենդանու մակարդակի ցուցանիշ է, ոչ թե ախտանիշի կամ ռեմիսիայի գնահատական։ Այն լրացուցիչ համատեքստ է տալիս՝ բլոտի արդյունքից դուրս, բայց ազդանշանման արդյունքը չի վերածում բուժման մասին պնդման։ Միտոքոնդրիալ օքսիդավերականգնման կարգավորման առանձին քիմիական գործընթացներն ընթանում են ցիտոկինների այս նկարագրությանը զուգահեռ և չպետք է միավորվեն դրա հետ։

Ուղիների համեմատություն․ ազդեցության կետեր և չափվող ցուցանիշներ

Աղյուսակը կանխում է արդյունքների երեք անհիմն ընդհանրացում։ ASC-ի կետային կուտակումների վերաբերյալ արդյունքը չի ապացուցում STAT3-ի վերաբերյալ արդյունք։ STAT1-ի՝ iNOS-ի պրոմոտորին կապվելու վերաբերյալ արդյունքը չի ապացուցում STAT3-ի վերաբերյալ արդյունք, թեև երկու սպիտակուցներն էլ STAT ընտանիքի անդամներ են։ Շիճուկային IL-6-ի վերաբերյալ արդյունքը չի ապացուցում ինֆլամասոմի հավաքման նվազում․ որովայնամզային փորձի ժամանակ IL-1beta-ն նվազել է, մինչդեռ IL-6-ը՝ ոչ։ Յուրաքանչյուր տող պահանջում է իր գործարկիչն ու չափվող ցուցանիշը։ Հենց այդ պատճառով մեթիլենային կապույտի բջջային, կենդանական և կլինիկական ուսումնասիրությունները կարդալիս անհրաժեշտ է յուրաքանչյուր պնդում համապատասխանեցնել դրա չափված մակարդակին։

Սրանցից ոչ մեկը չի հաստատում մարդկանց համար դոզավորումը, անվտանգությունը կամ օգուտը։ Լիպոպոլիսախարիդային մոդելները մեխանիզմ ստուգելու համար վերահսկվող գործարկիչներ են, ոչ թե քրոնիկ հիվանդության կրկնօրինակներ։ Իսկ գործարկիչի հետ մեկտեղ դոզա տալը ստուգում է հարուցված փոփոխության կանխարգելումը, ոչ թե արդեն ձևավորված հիվանդության հետադարձումը։ Մեխանիզմի այս նկարագրությունը տարանջատեք հիվանդների արդյունքներից և առողջությանը վերաբերող ցանկացած պնդում գնահատեք այն հիմնավորող՝ հիվանդների մասնակցությամբ ուսումնասիրության հիման վրա։