Մեթիլենային կապույտն ու ALS-ը․ ինչու են արդյունքները տարբերվում փորձարարական մոդելներում

Մեթիլենային կապույտի և ALS-ի մասին որոնելիս հանդիպում եք երկու պնդման, որոնք կարծես հակասում են միմյանց։ Մեկն ասում է, որ կապույտ ներկանյութը պաշտպանել է նեյրոնները ALS-ի մոդելներում։ Մյուսն ասում է, որ այն ոչինչ չի փոխել ALS-ի մկան մոդելում։ Երկու պնդումներն էլ հղվում են իրական գիտական հոդվածների, և երկու հոդվածներն էլ արժանի են լուրջ ուշադրության։ Հակասությունը վերանում է, երբ հստակ ձևակերպում եք յուրաքանչյուր փորձի հիմքում ընկած գաղափարը․ պնդման սահմանները որոշում է մոդելը։

Որդի մոտ ստացված արդյունքը պնդում է որդի մասին։ Ձկան թրթուրի մոտ ստացված արդյունքը պնդում է ձկան թրթուրի մասին։ Դրանցից ոչ մեկը պնդում չէ պացիենտի մասին, քանի դեռ դա չի հաստատվել կաթնասունի հիվանդության ընթացքի ուսումնասիրությամբ։ Այս հոդվածում զուգահեռ համեմատվում են առավել հաճախ մեջբերվող երկու գիտական հոդվածները, որպեսզի տեսնեք, թե ինչու են դրանց պատասխանները տարբերվում։

Երկու փորձերը՝ մեկ աղյուսակում

Ընթերցելիս այս աղյուսակը պահեք բաց։ Ուսումնասիրությունների բոլոր կարևոր տարբերություններն ընդգրկված են այստեղ։

Գենետիկան տարբեր է, տեսակները տարբեր են, դեղի ներմուծման ուղին տարբեր է, ժամանակային պայմանները տարբեր են, և վերջնակետերը տարբեր են։ Գենոտիպը հինգ տարբերություններից միայն մեկն է, ուստի այս երկու ուսումնասիրությունները չեն կարող ապացուցել, որ մեթիլենային կապույտն ընտրողաբար ազդում է ALS-ի որևէ մեկ մեխանիզմի վրա։ Դրանք ապացուցում են ավելի սահմանափակ, բայց դեռ օգտակար մի բան․ պարզ մոդելներում վաղ և անմիջական ազդեցության պայմաններում նկատված արտահայտված վերականգնումը չի կրկնվել կաթնասունի հիվանդության ընթացքի ընթացքում՝ երկարատև բերանային ընդունման պայմաններում։

Դրական արդյունքը․ ինչ ցույց տվեց որդերի և ձկների ուսումնասիրությունը

Որդերի և ձկների 2012 թվականի ուսումնասիրության ընթացքում որդերի շարժիչ նեյրոններում ապահովվել էր մարդու մուտանտ TDP-43-ի կամ FUS-ի արտահայտում, իսկ ձկների սաղմերի մեջ ներարկվել էր մարդու մուտանտ մՌՆԹ։ Սրանք սպիտակուցային թունավորության մոդելներ են։ Դրանք օրերի ընթացքում վերարտադրում են մուտանտ սպիտակուցի թունավոր ազդեցությունը շարժունակության և նեյրոնների ձևի վրա, ոչ թե տարիների ընթացքում զարգացող՝ չափահաս մարդու ALS-ի ամբողջ ընթացքը։

Բուժումը սկսվել էր շատ վաղ։ Որդերը ձվից դուրս գալուց սկսած աճել էին մեթիլենային կապույտ պարունակող ագարի վրա։ Ձկների սաղմերը բեղմնավորումից 24 ժամ անց մեկ գիշեր պահվել էին դեղի լուծույթում, իսկ վարքը ստուգվել էր մոտ երկու օր հետո։ Դեղի և նեյրոնի միջև չկար այնպիսի արյունաուղեղային պատնեշ, ինչպիսին կա կաթնասունի մոտ, և դեղի մակարդակը պլազմայում կամ ուղեղում չէր չափվել։

Այդ պայմաններում ազդեցությունները մեծ էին և հետևողական։ Թե՛ 6, թե՛ 60 μM-ը նվազեցրել էին տարիքից կախված կաթվածը TDP-43 և FUS որդերի մոտ։ Հասուն կյանքի 12-րդ օրը չբուժված TDP-43 որդերի մոտավորապես 80 տոկոսը կաթվածահար էր՝ ի տարբերություն ձվից դուրս գալուց սկսած բուժում ստացած որդերի մոտ 10 տոկոսի։ Սինապսային փորձը ևս նույն ուղղությունն էր ցույց տալիս․ TDP-43 որդերը գերզգայուն էին ալդիկարբի նկատմամբ՝ դեղ, որն օգտագործվում է նյարդամկանային հաղորդումը հետազոտելու համար, իսկ մեթիլենային կապույտն այդ արձագանքը մոտեցրել էր նորմային։ Նվազել էր դեգեներացվող շարժիչ նեյրոնների ելուստների թիվը, ընդ որում առավել հստակ ազդեցությունը դիտվել էր 60 μM-ի դեպքում։ Ձկների մոտ հպումից առաջացող լողը զգալիորեն բարելավվել էր, իսկ կարճացած շարժիչ աքսոնները 30 կամ 60 μM-ի պայմաններում աճել էին՝ մոտենալով նորմալ երկարությանը, թեև վերականգնումը մասնակի էր, ոչ թե ամբողջական։

Օքսիդատիվ սթրեսի տվյալները համապատասխանում էին հակաօքսիդանտային մեկնաբանությանը։ Մուտանտ որդերի և ձկների մոտ թթվածնի ռեակտիվ ձևերի ցուցանիշները բարձր էին և նվազում էին բուժման ընթացքում, իսկ մեթիլենային կապույտ ստացած նորմալ որդերը պրոօքսիդանտային ազդեցության պայմաններում շատ ավելի երկար էին գոյատևում, քան չբուժված որդերը։ Սակայն կարևոր են երկու սահմանափակումներ։ Մուտանտ TDP-43 և FUS սպիտակուցների ընդհանուր մակարդակները չէին նվազել, և ուսումնասիրության ընթացքում սպիտակուցային ագրեգատների քանակն ուղղակիորեն չէր չափվել։ Հետևաբար այն ցույց է տալիս գործառույթի վերականգնում՝ առանց ագրեգատների հեռացումն ապացուցելու։ Օքսիդավերականգնման և միտոքոնդրիալ վարկածների սովորական ձևակերպումներին հետևողները պետք է այս մեխանիզմը համարեն տվյալներով աջակցված, բայց ոչ վերջնականապես հաստատված։

Առավել ուսանելի մանրուքը բուժման մեկնարկի ժամանակն էր։ Երբ հեղինակները բուժումն սկսելու համար սպասել էին մինչև հասուն կյանքի 5-րդ օրը, 12-րդ օրվա կաթվածի հաճախականությունը կազմել էր մոտ 55 տոկոս՝ ձվից դուրս գալուց սկսած բուժման դեպքում դիտված մոտ 10 տոկոսի փոխարեն։ Նույն դեղը, նույն որդը, նույն մուտացիան, բայց շատ ավելի փոքր ազդեցություն։ Թվացյալ օգուտի մեծ մասը պայմանավորված էր վաղ կանխարգելիչ ազդեցությամբ։

Զրոյական արդյունքը․ ինչ ցույց տվեց SOD1 մկների ուսումնասիրությունը

Մկների 2011 թվականի ուսումնասիրությունը ավելի բարդ հարց էր առաջադրում ավելի խիստ համակարգում։ Կոնգենիկ SOD1 G93A մկների մոտ հիվանդությունն առաջադիմում է հետին վերջույթների դողից դեպի քայլքի խանգարում և մարմինը ճիշտ դիրքի վերադարձնելու ռեֆլեքսի կորուստ՝ հասնելով նախապես սահմանված վերջնական վերջնակետի։ Բուժումն սկսվել էր մինչև ախտանշանների ի հայտ գալը՝ 45-րդ օրը, և շարունակվել ամեն օր, իսկ դիտորդները նյարդաբանական վիճակը գնահատել էին 0-ից 6 սանդղակով։ Սա հիվանդության ամբողջ ընթացքն ընդգրկող փորձ է, ուստի ավելի մոտ է պացիենտի համար կարևոր հարցերին, քան որդի կաթվածի ցանկացած կոր։

Հիմնական արդյունքները զրոյական էին։ Ախտանշանների ընդհանուր սկիզբը վերահսկիչ խմբում արձանագրվել էր 121 օրում, իսկ մեթիլենային կապույտի դեպքում՝ 124 օրում․ տարբերությունը նշանակալի չէր։ Մինչև վերջնական փուլ ապրելիությունը կազմել էր 167 օր՝ 170 օրվա դիմաց, ինչը նույնպես նշանակալի տարբերություն չէր։ Մի քանի երկրորդային վերլուծություններ նպաստավոր էին բուժման համար․ էգերի մոտ ախտանշանների սկիզբը ուշացել էր մոտ 7 օրով, իսկ բուժված կենդանիները փոքր-ինչ ավելի երկար էին մնացել թեթև փուլերում և ավելի քիչ՝ ծանր փուլերում։ Սեռային ենթախմբերի փոքր չափերի և փուլերի բազմաթիվ համեմատությունների պայմաններում այս արդյունքները պետք է դիտարկել որպես վարկածներ առաջադրող, ոչ թե որպես ապացույց։ Չէին կատարվել նեյրոնների հաշվարկ, SOD1-ի ագրեգացիայի փորձ կամ օքսիդատիվ ու բորբոքային մարկերների չափումներ։ Ուստի ուսումնասիրությունը նաև չի կարող պարզել՝ դեղը հասե՞լ էր իր թիրախներին և չէր գործել, թե՞ այս դեղաչափով ընդհանրապես չէր ազդել դրանց վրա։ Փորձարկվել էր միայն մեկ դեղաչափ։

Հեղինակներն իրենք ընդգծել էին ամենահիմնական սահմանափակումը, որը գործում է երկու ուղղությամբ էլ։ SOD1 G93A-ի մեծ թվով պատճեններով մոդելը լավ է վերարտադրում SOD1-ի թունավորությամբ պայմանավորված հիվանդությունը, բայց SOD1-ով պայմանավորված հիվանդությունը կազմում է ընտանեկան ALS-ի փոքր մասը և կենսաբանական առումով տարբերվում է սպորադիկ դեպքերի մեծամասնությունից։ Նրանք առաջարկել էին թեկնածու միջոցները կրկին փորձարկել TDP-43-ի վրա հիմնված կաթնասունների մոդելներում։ Այդ առաջարկը հետագայում ավելի բարդ է դարձել, քանի որ որդերի և ձկների ուսումնասիրության հեղինակները նշում են, որ մեթիլենային կապույտի առանձին ուսումնասիրությունը TDP-43 մկների մոտ նույնպես չի բարելավել շարժողական արդյունքները։ Այսպիսով, միացությունը կարող է արտահայտված ազդեցություն ցույց տալ մի TDP-43 համակարգում և չեզոք արդյունք՝ մեկ այլ TDP-43 համակարգում։ Համակարգը նույնքան կարևոր է, որքան գենը։

Ինչու որդի կամ ձկան մոտ բարելավումը չի կարող հաստատել օգուտը պացիենտների համար

Յուրաքանչյուր մոդել դիտարկեք որպես տարբեր հարցի պատասխան։

Նախ՝ կենսաբանությունն է տարբեր։ TDP-43-ն ու FUS-ը նուկլեինաթթուներ կապող սպիտակուցներ են, որոնք այս պարզ համակարգերում ունեն ընդհանուր գենետիկական փոխազդեցություններ, մինչդեռ SOD1-ի թունավորությունը դրսևորվում է մասամբ տարբեր անմիջական մեխանիզմներով։ Մի տեսակի սպիտակուցային թունավոր սթրեսը մեղմող դեղը պարտադիր չէ, որ մեղմի նաև մյուսը։ Սաղմնային գերարտահայտման դեմ հաջողությունը պարտադիր չէ, որ կանխատեսի հաջողություն հասուն օրգանիզմի դանդաղ նեյրոդեգեներացիայի դեմ, որն ուղեկցվում է բորբոքմամբ, գլիալ բջիջների ներգրավմամբ և օրգանիզմի ընդհանուր վիճակի վատթարացմամբ։

Երկրորդ՝ ազդեցության պայմաններն են տարբեր։ Միկրոմոլային կոնցենտրացիաներով շարունակական ընկղմումը նույնը չէ, ինչ բերանային ընդունումը։ Կուլ տված դեղաչափի և ողնուղեղի շարժիչ նեյրոնի միջև առկա են աղիքային ներծծումը, առաջին անցման նյութափոխանակությունը, պլազմայի սպիտակուցների հետ կապումը, ուղեղ ներթափանցումը և օրգանիզմից հեռացումը։ Ոչ մի ուսումնասիրություն չի չափել դեղի մակարդակները նյարդային համակարգում, ուստի դրանցից ոչ մեկը չի կարող իր կիրառած կոնցենտրացիան կապել մյուսի հետ։

Երրորդ՝ ժամանակային պայմաններն են տարբեր։ Որդերի և ձկների մոտ օգուտը մեծապես կախված էր ախտաբանական փոփոխությունների կուտակումից առաջ սկսված բուժումից։ Մկների բուժումը նույնպես սկսվել էր մինչև ախտանշանները, ինչը ուսումնասիրության ուժեղ կողմն է, սակայն մարդկանց բուժումը գրեթե միշտ կսկսվեր ախտանշանների ի հայտ գալուց հետո՝ էլ ավելի ուշ։ Երկօրյա սաղմնային փորձի կանխարգելիչ ազդեցության ազդակը հետազոտության մեկնակետ է, ոչ թե կլինիկական կիրառման մոդել։

Չորրորդ՝ վերջնակետերն են տարբեր։ Կաթվածը 12 օրում, ալդիկարբի նկատմամբ զգայունությունը, աքսոնի երկարությունը միկրոմետրերով և լողի հեռավորությունը անմիջական ֆենոտիպային ցուցանիշներ են։ Կաթնասունի մոտ ախտանշանների սկիզբն ու ապրելիությունն ամփոփում են օրգանիզմի բոլոր փոխհատուցող և բարդացնող գործընթացները։ Դեղերը հաճախ փոխում են անմիջական ցուցանիշները՝ առանց ապրելիությունը փոխելու։ Հենց այդ պատճառով էլ կաթնասունների ուսումնասիրություններում կիրառվում են մինչև իրադարձությունը ժամանակը չափող վերջնակետեր։

Հաջորդ վերնագիրը գնահատելու համար ստուգացանկ փնտրող ընթերցողները կարող են օգտվել նախակլինիկական ուսումնասիրություններ կարդալու ուղեցույցից․ պարզեք տեսակը, տրանսգենը, դեղաչափն ու ներմուծման ուղին, չափվե՞լ են արդյոք դեղի մակարդակները, ախտաբանական փոփոխությունների համեմատ ե՞րբ է սկսվել բուժումը, վերջնակետը կարճաժամկետ ֆենոտի՞պ էր, թե՞ հիվանդության ընթացք, և արդյոք ազդեցությունը վերարտադրվել է երկրորդ լաբորատորիայում։ Մեթիլենային կապույտի՝ մարդկանց վերաբերյալ ավելի լայն ապացույցների բազան մնում է այն աղբյուրը, որտեղ պետք է ստուգել՝ արդյոք այս վաղ ազդակներից որևէ մեկը վերածվել է կլինիկական տվյալների։

Ինչ է սա նշանակում պացիենտների և ընտանիքների համար

Այս հոդվածներից չի բխում ALS-ի համար մեթիլենային կապույտի որևէ հաստատված կիրառման սխեմա։ Դրական ուսումնասիրությունը հիմք է տալիս TDP-43-ի և FUS-ի կենսաբանության օքսիդատիվ ու սինապսային մեխանիզմների հետագա հետազոտության համար։ Զրոյական արդյունքով ուսումնասիրությունը հակափաստարկ է այս ազդեցության մակարդակով երկարատև բերանային ընդունումից SOD1 տիպի հիվանդության ընթացքի փոփոխություն ակնկալելու դեմ։ Միասին դրանք նկարագրում են տարբեր մոդելների միջև անհամապատասխանություն, ոչ թե բուժման առաջարկություն։

Անվտանգությունը պահանջում է նույնքան սթափ մոտեցում, որքան արդյունավետությունը։ Մկների մոտ ALS-ի ուսումնասիրությունները ոչինչ չեն ասում մարդկանց համար անվտանգ դեղաչափերի մասին, իսկ մեթիլենային կապույտն իրական ռիսկեր է պարունակում՝ G6PD-ի անբավարարության դեպքում հեմոլիզի և սերոտոնիներգիկ դեղերի հետ համակցման դեպքում սերոտոնինային թունավորության պատճառով։ G6PD-ի անբավարարության կասկածը, հակադեպրեսանտների ընթացիկ օգտագործումը և դեղորայքի ցանկացած նախատեսվող փոփոխություն պետք է քննարկվեն բժշկի հետ։ Նույնը վերաբերում է մեթիլենային կապույտի անվտանգության ընդհանուր տվյալների ուսումնասիրությանը՝ նախքան որևէ մեկը լաբորատոր արդյունքների վերնագրերի հիման վրա քայլեր ձեռնարկի։

Հիմնական եզրակացությունը տեղավորվում է մեկ նախադասության մեջ։ Մեթիլենային կապույտը վաղ ազդեցության պայմաններում արտահայտված վերականգնում է ապահովել TDP-43 և FUS որդերի ու ձկների թրթուրների ֆենոտիպերում, իսկ SOD1 մկների՝ երկարատև բերանային ընդունմամբ ուսումնասիրության ընթացքում գործնականում չի տվել օգուտ ախտանշանների սկզբի կամ ապրելիության առումով։ Ուստի ազնիվ մեկնաբանությունն այն է, որ ապացույցները կախված են մոդելից և չեն հիմնավորում պացիենտների մոտ կիրառումը։