Մեթիլեն կապույտը G6PD-ի լաբորատոր հետազոտություններում․ իրականում ինչ է անում ներկանյութը

Ուսանողը ինկուբացիայից հետո դիտում է երկու փորձանոթ։ Մեկը ստացել է սպասվող գույնը։ Մյուսը՝ ոչ։ Ուսանողը եզրակացնում է, որ երկրորդ պացիենտն ունի գլյուկոզ-6-ֆոսֆատ դեհիդրոգենազի անբավարարություն։ Այդ եզրակացությունը կարող է ճիշտ լինել, բայց նման դատողությունը բաց է թողնում այն հասկացությունը, որի շնորհիվ թեստն աշխատում է։ Փորձանոթում ոչինչ ուղղակիորեն չի չափում ֆերմենտը։ Փորձանոթում չափվում է այն, ինչ ֆերմենտն արտադրում է՝ մեթիլեն կապույտն օգտագործելով որպես միջնորդ։

Երբ այս անուղղակի մեխանիզմը պարզ է դառնում, ընթացակարգը, հսկիչ նմուշները և կեղծ արդյունքների երկար ցանկն այլևս կամայական չեն թվում։

Կարճ պատասխանը

G6PD-ի հետազոտությունում մեթիլեն կապույտը օքսիդավերականգնման ցուցիչ է։ G6PD ֆերմենտն առաջացնում է NADPH, իսկ NADPH-ից կախված համակարգերը կապույտ մեթիլեն կապույտը վերականգնում են մինչև դրա անգույն լեյկո ձևը կամ օգտագործում են այն էլեկտրոններ փոխանցելու համար։ Ֆերմենտի բնականոն ակտիվությունն ապահովում է արդյունավետ վերականգնում։ Անբավարար ակտիվության դեպքում վերականգնումը դանդաղ է կամ ոչ լիարժեք։ Ահա ամբողջ ազդանշանը։

Պատմական երկու մեթոդներն օգտագործում են նույն ներկանյութը, բայց տարբերվում են վերջնակետով։ Դրանք իրարից տարբերակելու դեպքում շփոթության մեծ մասը վերանում է։

Երկու թեստ, մեկ ներկանյութ, տարբեր վերջնակետեր

Առաջինը մեթիլեն կապույտի ուղղակի վերականգնման թեստն է, որը նկարագրել են Սասն ու գործընկերները, իսկ հետագայում գնահատել է Գիբսը։ Այստեղ վերջնակետը հենց ներկանյութն է․ օքսիդացված կապույտ մեթիլեն կապույտը վերականգնվում է՝ դառնալով անգույն լեյկոմեթիլեն կապույտ, իսկ այդ փոփոխության արագությունն արտացոլում է NADPH առաջացնելու կարողությունը։ Սքրինինգի սկզբնական հոդվածը գրանցված է PubMed-ում՝ Սասի և համահեղինակների անուններով (1966)։

Երկրորդը Բրյուերի մեթհեմոգլոբինի վերականգնման թեստն է։ Նատրիումի նիտրիտը նախ հեմոգլոբինն օքսիդացնում է մինչև շագանակագույն մեթհեմոգլոբին։ Այնուհետև մեթիլեն կապույտը գործում է որպես էլեկտրոնների փոխանցման միջնորդ․ վերականգնված մեթիլեն կապույտը վերականգնող համարժեքներ է փոխանցում մեթհեմոգլոբինին՝ այն կրկին վերածելով կարմիր հեմոգլոբինի։ Հետևաբար տեսանելի վերջնակետը շագանակագույնի և կարմիրի տարբերությունն է, ոչ թե կապույտի և անգույնի։ Սկզբնական մեթոդը հրապարակվել է Առողջապահության համաշխարհային կազմակերպության տեղեկագրում (Բրյուեր և համահեղինակներ, 1960)։

Բրյուերի հետազոտությունը ներկանյութի գունազրկման թեստ անվանելը քիմիական առումով ճշգրիտ չէ։ Ներկանյութն անցնում է օքսիդավերականգնման ցիկլերով, իսկ գույնը փոխում է հեմոգլոբինը։ Ստորև բերված գծապատկերը ցույց է տալիս երկու ուղիները։

Հիմքում ընկած ռեակցիան

G6PD-ն կատալիզում է պենտոզաֆոսֆատային ուղու առաջին օքսիդացման փուլը․

Glucose-6-phosphate + NADP+ becomes 6-phosphogluconolactone + NADPH + H+

Հասուն էրիթրոցիտները NADPH ստանալու համար մեծապես կախված են այս ուղուց, ինչպես ամփոփված է Blood ամսագրում Լուցատոյի և գործընկերների ակնարկում (2020)։ NADPH-ը գլուտաթիոնը պահպանում է վերականգնված վիճակում և պաշտպանում բջիջը օքսիդատիվ վնասումից։ Մեթիլեն կապույտն այս համակարգում ներգրավվում է որպես էլեկտրոնների ընդունիչ։ G6PD-ի բավարար ակտիվությունն ապահովում է բավարար NADPH, որն իր հերթին ապահովում է արդյունավետ վերականգնում։ G6PD-ի ցածր ակտիվությունը շղթան խզում է հենց առաջին օղակում։

Ներկանյութը պատկերացրեք որպես վառելիքի մակարդակի ցուցիչ, ոչ թե շարժիչ։ Այն տեղեկություն է տալիս NADPH-ի պաշարի մասին։ Ցանկացած այլ գործոն, որը փոխում է այդ պաշարը կամ արդյունքի ցուցադրումը, կարող է տեղաշարժել ցուցիչի սլաքը՝ առանց գենի որևէ փոփոխության։

Ինչպես է կատարվում Բրյուերի տիպի ընթացակարգը

Ռեագենտների բաղադրատոմսերը տասնամյակների ընթացքում փոփոխվել են, ուստի ուսուցողական նկարագրությունը չպետք է շփոթել կլինիկական արձանագրության հետ։ Յուրաքանչյուր լաբորատորիա հետևում է իր վավերացված ստանդարտ գործառնական ընթացակարգին։ Այս վերապահումով՝ փորձանոթներով դասական տարբերակն իրականացվում է հետևյալ կերպ՝ երեք փորձանոթով և 3-ժամյա ինկուբացիայով, ինչպես փաստագրված է այս հրապարակված կիրառման նկարագրության մեջ․

1. Պացիենտի փորձանոթ․ ամբողջական արյուն՝ գլյուկոզի, նատրիումի նիտրիտի և մեթիլեն կապույտի հավելումով։ Նիտրիտն առաջացնում է մեթհեմոգլոբին, գլյուկոզն ապահովում է էրիթրոցիտների նյութափոխանակության սուբստրատը, իսկ ներկանյութը կատարում է NADPH-ից կախված փոխանցողի դերը։
2. Օքսիդացված հսկիչ նմուշ․ արյուն՝ նիտրիտի և գլյուկոզի հավելումով, բայց առանց մեթիլեն կապույտի։ Այն ցույց է տալիս շագանակագույն մեթհեմոգլոբինի վերջնակետը՝ անբավարարությանը բնորոշ պատկերը։
3. Հեմոգլոբինային հսկիչ նմուշ․ արյուն՝ ջրի հավելումով։ Այն ցույց է տալիս կարմիր հեմոգլոբինի վերջնակետը՝ բնականոն պատկերը։
4. Ինկուբացնել բոլոր փորձանոթները մոտ 37 C ջերմաստիճանում, սովորաբար 3 ժամ՝ մեղմ խառնելով։
5. Նոսրացնել յուրաքանչյուր փորձանոթից վերցված փոքր բաժինը թորած ջրում՝ բջիջները լիզելու և գույների համեմատությունը տեսանելի դարձնելու համար։
6. Համեմատել պացիենտի փորձանոթը երկու հսկիչ նմուշների հետ։ Կարմիր գույնի վերադարձը ցույց է տալիս զգալի վերականգնող կարողություն։ Շագանակագույն գույնի պահպանումը ենթադրում է արտահայտված անբավարարություն։

Պատմական բաղադրատոմսերից մեկում օգտագործվել է մոտ 1 mL արյուն՝ մոտ 180 mM նատրիումի նիտրիտ, 280 mM դեքստրոզ և 0.4 mM մեթիլեն կապույտ պարունակող ռեագենտներով։ Այս թվերը դիտարկեք որպես գրականությունից վերցված օրինակ, ոչ թե համընդհանուր սահմանված չափորոշիչ։

Արդյունքի մեկնաբանումը

Որակական սքրինինգը լավագույնս տարբերակում է բնականոն ակտիվության մոտ 30-ից 40 տոկոսի միջակայքում, ինչպես քննարկվում է Malaria Journal-ի այս ակնարկում՝ G6PD-ի հայտնաբերման բացերի մասին։ Հետևաբար սքրինինգի բնականոն արդյունքը նշանակում է, որ հետազոտությունը չի հայտնաբերել ծանր անբավարարություն։ Այն չի հաստատում լիովին բնականոն ակտիվություն։

Ինչու կարող է սքրինինգը մոլորեցնել

Հեմոլիզից հետո ռետիկուլոցիտոզը կեղծ բնականոն արդյունքի դասական պատճառն է։ Երիտասարդ էրիթրոցիտներն ու ռետիկուլոցիտները պարունակում են ավելի շատ G6PD, քան ծեր բջիջները։ Սուր հեմոլիզի դրվագի ժամանակ ամենածեր և ամենաարտահայտված անբավարարություն ունեցող բջիջները կարող են արդեն քայքայված լինել՝ թողնելով երիտասարդ բջիջների պոպուլյացիա, որի ակտիվությունը հետազոտությամբ բնականոն է գնահատվում։ Նույն կենսաբանական երևույթը մոլորեցնում է նաև քանակական հետազոտությունները, ոչ միայն ներկանյութով սքրինինգը։

Վերջերս կատարված արյան փոխներարկումը քողարկում է անբավարարությունը, քանի որ դոնորի էրիթրոցիտները նմուշին ավելացնում են իրենց ֆերմենտը։ Mayo Clinic Laboratories-ը փոխներարկումը նշում է ֆերմենտային հետազոտությունների անվստահելի արդյունքների պատճառների շարքում՝ ռետիկուլոցիտոզի և լեյկոցիտների խանգարող ազդեցության հետ միասին։

Հետերոզիգոտ կանանց դեպքում գնահատումն ամենադժվարն է։ X քրոմոսոմի պատահական ապաակտիվացումն առաջացնում է բնականոն և անբավարար էրիթրոցիտների խառնուրդ, իսկ ընդհանուր ակտիվությունը կարող է լինել ցանկացած մակարդակում՝ արտահայտված անբավարարից մինչև թվացյալ բնականոն։ Որակական սքրինինգները հաճախ բաց են թողնում միջանկյալ ֆենոտիպերը։ ԱՀԿ-ի՝ G6PD-ի հետազոտության վերաբերյալ փաստաթղթերում այս սահմանափակումը մանրամասն քննարկվում է։

Նմուշի վերցնելուց անցած ժամանակը, պահպանման ջերմաստիճանը, տեսողական վերջնակետի գնահատման սուբյեկտիվությունը, հեմատոկրիտը և ռեագենտների որակը այս կենսաբանական ազդեցություններին ավելացնում են նաև վերլուծական աղմուկ։

Սքրինինգը ախտորոշում չէ

Անբավարարություն ցույց տվող, միջանկյալ կամ կլինիկական պատկերին չհամապատասխանող սքրինինգային արդյունքը պահանջում է G6PD ֆերմենտի քանակական հետազոտություն։ ԱՀԿ-ն հղումային մոտեցում է համարում վերահսկվող ջերմաստիճանի պայմաններում քանակական սպեկտրոֆոտոմետրիան։ Այդ հետազոտության ժամանակ էրիթրոցիտների հեմոլիզատին ավելացվում են գլյուկոզ-6-ֆոսֆատ և NADP+, իսկ առաջացած NADPH-ին հետևում են 340 nm ալիքի երկարության դեպքում կլանման աճով։ Փոփոխության արագությունը համեմատական է ֆերմենտի ակտիվությանը և սովորաբար նորմավորվում է ըստ հեմոգլոբինի՝ մեկ գրամին բաժին ընկնող միավորներով։ Կլինիկական լաբորատորիաների ներկայիս գործելակերպն ամփոփված է Mayo-ի հետազոտությունների կատալոգի՝ G6PD-ի ակտիվությանը նվիրված բաժնում։

Մեկնաբանման համար օգտագործվում է լաբորատորիայի վավերացված հղումային միջակայքը, որը հաճախ ներկայացվում է բնակչության բնականոն ակտիվության համեմատությամբ․ անբավարարությունը սովորաբար քննարկվում է մոտ 30 տոկոսի շեմի շրջանում, իսկ միջանկյալ ակտիվությունը՝ դրանից բարձր։ G6PD-ի թեստերի համար ԱՀԿ-ի արտադրանքի թիրախային բնութագրերը (2022) սահմանում են այդ ախտորոշիչ շրջանակը։ Եթե վերջերս տեղի ունեցած հեմոլիզը կամ փոխներարկումը ֆենոտիպի որոշումը դարձնում են անվստահելի, հետազոտությունը կրկնվում է էրիթրոցիտների պոպուլյացիայի հավասարակշռության վերականգնումից հետո, իսկ մոլեկուլային հետազոտությունը կարող է լրացուցիչ տեղեկություն տալ՝ առանց փոխարինելու ֆերմենտի չափմանը։

Սահմանազատում, որը կարևոր է պահպանել

Այս հետազոտություններում մեթիլեն կապույտը ex vivo լաբորատոր ռեագենտ է։ Այս փաստը վերաբերում է այլ հարցի, քան պացիենտին մեթիլեն կապույտ տալու անվտանգությունը, որը ներկայացված է մեթիլեն կապույտի հակացուցումների վերաբերյալ ուղեցույցում։ Կենսաքիմիան կապում է այդ երկու թեմաները, քանի որ դեղանյութը նույնպես կախված է NADPH-ից կախված վերականգնումից, բայց փորձանոթի ներկանյութը նույնը չէ, ինչ արյան շրջանառության մեջ ներմուծված դեղաչափը։ Այլ պայմաններում ներկանյութի՝ որպես ներկող նյութի վարքը հասկանալու համար տեսեք մեթիլեն կապույտով ներկման սկզբունքները, իսկ դրա քիմիական ընտանիքի մասին տեղեկությունների համար՝ լաբորատորիայում օգտագործվող օքսիդավերականգնման ներկանյութերի թեման։

Սքրինինգը հարցնում է՝ արդյոք վերականգնող կարողությունը պահպանված է թվում։ Հաստատող հետազոտությունը հարցնում է՝ իրականում որքան ֆերմենտ կա։ Ներկանյութը լավ է ծառայում առաջին հարցին, եթե ոչ ոք դրանից չի պահանջում պատասխանել երկրորդին։