Մեթիլեն կապույտի տրամաչափարկման կորի կառուցումը․ զրոյական նմուշներ, միջակայք և գծայնություն

Երկու վերլուծաբան օգտագործում են մեթիլեն կապույտի նույն ելային լուծույթի շիշը և յուրաքանչյուրը կառուցում է տրամաչափարկման կոր։ Առաջինը ստանում է կոորդինատների սկզբնակետով անցնող ուղիղ գիծ և վստահորեն չափում անհայտ նմուշները։ Երկրորդը ստանում է վերին հատվածում կորացող գիծ, զրոյին չմոտեցող ազատ անդամ և նոսրացումից կախված փոփոխվող նմուշների արդյունքներ։ Նույն ներկանյութը, նույն սարքը, նույն ալիքի երկարությունը։ Տարբերությունը հմտությունը չէ։ Այն փորձի պլանավորումն է՝ ինչ է ներառվել զրոյական նմուշում, որ կոնցենտրացիաներն են ընտրվել, և արդյոք ստուգված միջակայքը մնացել է այն տիրույթում, որտեղ մեկ պարզ մոդելը դեռ գործում է։

Տրամաչափարկման կորը սարքի արձագանքի և կոնցենտրացիայի միջև պայմանավորվածություն է, որն ուժի մեջ է միայն այն պայմաններում, որոնցում կառուցվել է։ Մեթիլեն կապույտի դեպքում այդ պայմանավորվածությունն ունի հայտնի թույլ կետ։ Ներկանյութը ջրում ինքնաասոցացվում է, ուստի լույս կլանող մասնիկների տեսակը փոխվում է կոնցենտրացիայի հետ։ Այդ փոփոխությունն ընդգրկող կորը ուղիղ չի լինի, և ոչ մի վիճակագրական մշակում դա չի շտկի։ Այս հոդվածը ցույց է տալիս, թե ինչպես նախագծել կորը, որպեսզի գիծն իմաստ ունենա․ ընտրել ճիշտ զրոյական նմուշը, միջակայքը պահել մոնոմերի գերակշռության տիրույթում, կատարել իսկապես անկախ կրկնություններ և կորությունը դիտարկել որպես տեղեկություն, ոչ թե աղմուկ։

Սկսեք զրոյական նմուշից, ոչ թե ստանդարտներից

Զրոյական նմուշը սահմանում է զրոն, և մեթիլեն կապույտի դեպքում այն պետք է պարունակի ամեն ինչ՝ բացի ներկանյութից։ Ջրի նույն որակը, նույն բուֆերը և pH-ը, նույն աղերը, նույն համալուծիչի բաժինը, նույն ջերմաստիճանը։ Տրամաչափարկման ստանդարտները պատրաստեք այդ նույն մատրիցում։ Պատճառը քիմիական է, ոչ թե ձևական։ Աղը և լուծիչը տեղաշարժում են մոնոմերի, դիմերի և ավելի բարձր կարգի ագրեգատների միջև հավասարակշռությունը, ինչը փոխում է սպեկտրը չափման ալիքի երկարության վրա։ Միայն ջրից կազմված զրոյական նմուշը չի կարող շտկել մատրիցի առաջացրած փոփոխությունը քիմիական ձևերի բաշխման մեջ։ Ջրում մեթիլեն կապույտի սպեկտրների համընդհանուր վերլուծության մեջ, որը հասանելի է բաց հասանելիության գրառմամբ, նատրիումի քլորիդի կոնցենտրացիան փոփոխվել է 0-ից մինչև 0.15 M հենց այն պատճառով, որ իոնային ուժը տեղաշարժում է հավասարակշռությունը, իսկ աղի ավելացմամբ ագրեգացումը մեծանում է։

Գործնական հետևանքներից մեկը․ երբեք մի տրամաչափարկեք դեիոնացված ջրում, ապա չափեք նմուշները ֆոսֆատային բուֆերում կամ կեղտաջրի ֆիլտրատում։ Երբ անալիտ չպարունակող մատրից չկա, անմիջապես նմուշին ստանդարտի ավելացումը գերադասելի է չհամապատասխանող արտաքին կորից։ Ջրային միջավայրում վերլուծությունների հավաստիությունը պահպանելու վերաբերյալ ուղեցույցը ներկայացված է մատրիցի և խանգարող ազդեցությունների քննարկման մեջ, իսկ ներկանյութերի քանակական վերլուծության ընդհանուր սկզբունքները՝ վերլուծության պլանավորման ակնարկում։

Ընտրեք միջակայք, որտեղ մեկ տեսակն է գերակշռում

664 nm-ի մոտ գտնվող երկարալիքային գոտում քանակական որոշումը ենթադրում է, որ ներկանյութի մեծ մասը մոնոմերային ձևով է։ Պարզ ջրում այդ ենթադրությունը գործում է միայն նոսր լուծույթների դեպքում՝ մոտավորապես ցածր միկրոմոլյար տիրույթում։ Հրապարակված փորձարարական թեքությունները ցույց են տալիս սահմանը․ 1 cm կյուվետներում մոտ 7 միկրոմոլյարից ցածր պահվող տրամաչափարկումները տալիս են մոտ 82,000 M-1 cm-1 թեքություն, մինչդեռ մինչև մոտ 37 միկրոմոլյար ընդլայնված տրամաչափարկման դեպքում այն նվազում է մինչև մոտ 67,100, քանի որ վերին ստանդարտներն արդեն պարունակում են դիմերի զգալի քանակ։ Այստեղ նշված յուրաքանչյուր գործակցի պայմանները ներկայացված են մեթիլեն կապույտի սպեկտրային տեղեկատուում, որը թվերը համեմատելու ճիշտ աղբյուրն է․ այս հոդվածում դրանք օգտագործվում են միայն միջակայքը սահմանելու համար։

Պլանավորման կանոնները բխում են անմիջապես դրանից․

1. Ամենաբարձր կոնցենտրացիայով ստանդարտը պահեք այնքան նոսր, որ սպեկտրի ձևը կայուն մնա։ Մեթոդի մշակման ընթացքում յուրաքանչյուր մակարդակի համար սկանավորեք ամբողջ տեսանելի տիրույթը՝ մոտ 550-ից մինչև 750 nm, մեկ ալիքի երկարության վրա չափելու փոխարեն։ Եթե նորմավորված սպեկտրների ձևը փոխվում է կոնցենտրացիայի հետ, քիմիական վիճակը փոխվում է, և միջակայքը չափազանց լայն է։
2. Տարբեր մակարդակներում հետևեք 610 nm-ի մոտ աբսորբանսի և 665 nm-ի մոտ աբսորբանսի հարաբերությանը։ Կոնցենտրացիայի հետ աճող հարաբերությունը նշանակում է, որ դիմերի ուսը մեծանում է, և մոնոմերային մոդելն այլևս չի գործում։ Այս ախտորոշիչ մոտեցումն ավելի մանրամասն բացատրված է ագրեգացման և կոնցենտրացիայի ազդեցությունների ուղեցույցում։
3. Ցածր միկրոմոլյար տիրույթում աշխատանքի համար օգտագործեք 1 cm կյուվետ։ Մոտ 82,000 թեքության դեպքում 5 միկրոմոլյարը տալիս է մոտ 0.41 աբսորբանս, իսկ 10 միկրոմոլյարը՝ մոտ 0.82․ երկուսն էլ հարմար են սարքերի մեծ մասի համար։
4. Խիտ ելային լուծույթների դեպքում կրճատեք օպտիկական ուղին՝ 1-ից շատ բարձր աբսորբանս ընդունելու փոխարեն, բայց հիշեք, որ կարճ ուղին շտկում է լուսաչափական խնդիրը, ոչ թե քիմիականը։ Ագրեգացումը կախված է կոնցենտրացիայից, ոչ թե ուղու երկարությունից, ուստի խիտ ելային լուծույթին դեռ անհրաժեշտ է քիմիական ձևերի բաշխումը հաշվի առնող առանձին մոտեցում, ոչ թե նոսր մոնոմերային կոր։

Այս պատկերի մեծ մասի հիմքում ընկած համընդհանուր մոդելային համապատասխանեցումն ընդգրկել է 224 սպեկտր՝ 1.1 միկրոմոլյարից մինչև 3.4 միլիմոլյար, և ցույց տվել, որ տետրամերի ազդանշանն արդեն հայտնաբերելի է 34 միկրոմոլյարից ցածր։ Այս արդյունքը հուշում է հիմնական մոտեցումը․ գծային տիրույթն ավելի նեղ է, քան կարելի է ինտուիտիվորեն ենթադրել, ուստի ստուգեք այն, ոչ թե ընդունեք որպես տրված։

Մակարդակներ, կրկնություններ և հերթականություն

Երեք կետով կորը ոչինչ չի ապացուցում։ ICH Q2(R2)-ի վավերացման ուղեցույցը գծայնությունը գնահատելու համար պահանջում է առնվազն հինգ կոնցենտրացիա, իսկ վեցից ութ ոչ զրոյական մակարդակները տալիս են ավելի համոզիչ աշխատանքային կոր, հատկապես վերին հատվածում, որտեղ սկսվում է ագրեգացումը։ Մակարդակներն ընտրեք այնպես, որ ընդգրկեն նախատեսված նմուշների միջակայքը՝ ավելի խիտ դասավորությամբ այնտեղ, որտեղ կորությունն առավել հավանական է, ոչ թե հարմարության համար ընտրված երկրաչափական շարքով։

Յուրաքանչյուր մակարդակ չափեք երկու կամ երեք կրկնությամբ՝ պատրաստելով դրանք անկախ, ոչ թե նույն կոլբայից երեք անգամ չափելով։ Անկախ կրկնությունները բացահայտում են պատրաստման սխալը, իսկ մեկ կոլբայի կրկնակի չափումները՝ միայն սարքի աղմուկը։ 2020 թվականի համընդհանուր ուսումնասիրության մեջ յուրաքանչյուր լուծույթ չափվել է երեք անգամ, ինչը մնում է հիմնավոր լռելյայն մոտեցում։ Չափումների հերթականությունը պատահականացրեք, որպեսզի դրեյֆը, ապակու վրա ադսորբցիան կամ ջերմաստիճանի փոփոխությունը չընկալվեն որպես կորություն։ Քվարցե կյուվետների ուսումնասիրությունը ցույց է տվել, որ 34 միկրոմոլյար լուծույթից ներկանյութի մոտ 3 տոկոսը ադսորբցվում է 10 րոպեի ընթացքում, ուստի ամբողջ չափումների շարքում միատեսակ պահեք շփման տևողությունը, կյուվետը, մաքրումը և հաջորդականությունը։

Ցուցադրական հաշվարկային օրինակ՝ ոչ չափված տվյալներ

Ստորև բերված թվերը հորինված են՝ հաշվարկը ցույց տալու համար։ Դրանք լաբորատոր չափումներ չեն և չպետք է մեջբերվեն որպես մեթիլեն կապույտի տվյալներ։ Կարևորը դրանց շուրջ իրականացվող ստուգումների տրամաբանությունն է։

Ենթադրենք՝ համապատասխան բուֆերում պատրաստված վեց ստանդարտներ, 1 cm օպտիկական ուղի, չափում 665 nm-ի վրա՝ համապատասխան զրոյական նմուշի նկատմամբ․

Միջին աբսորբանսի՝ կոնցենտրացիայից կախվածության ուղիղ գծով համապատասխանեցումը տալիս է մոտ 0.0805 աբսորբանսի միավոր մեկ միկրոմոլյարի հաշվով թեքություն և զրոյից ընդամենը մի քանի միլիաբսորբանսի միավորով տարբերվող ազատ անդամ։ Թեքությունը ուղու երկարությանը բաժանելով՝ այն վերածվում է թվացյալ կլանման գործակցի․ մեկ միկրոմոլյարի հաշվով 0.0805-ը հավասար է մոտ 80,500 M-1 cm-1-ի, ինչը համապատասխանում է ջրում մոնոմերի գերակշռությամբ միջակայքին։ Կարևոր ստուգումը R քառակուսին չէ, որը երկու դեպքում էլ գերազանց տեսք կունենա։ Կարևոր են զրոյին մոտ ազատ անդամը, S2-ից մինչև S5 հաստատուն A610/A665 հարաբերությունը և առանց միտումի ցրված մնացորդները։ S6-ում հարաբերության աճը հստակ ազդանշան է՝ կամ հեռացնելու այդ մակարդակը, կամ 7 միկրոմոլյարը նշելու որպես մատրիցի և սարքի այս համակցության միջակայքի նախնական վերին սահման։

Նույն պայմաններում 0.245 ցուցմունքով անհայտ նմուշի կոնցենտրացիան հաշվարկվում է անմիջապես․ 0.245-ը մեկ միկրոմոլյարի հաշվով 0.0805-ին բաժանելը տալիս է մոտ 3.0 միկրոմոլյար՝ նախքան նմուշի նոսրացման որևէ գործակից կիրառելը։ Արդյունքը ներկայացրեք պայմանների հետ միասին՝ ալիքի երկարություն, օպտիկական ուղի, զրոյական նմուշի մատրից, տրամաչափարկման միջակայք և ամսաթիվ։

Լրացվող տրամաչափարկման աշխատանքային թերթ

Յուրաքանչյուր նոր մատրիցի համար այս ձևանմուշը պատճենեք լաբորատոր գրանցամատյանում։ Մեկ մատրից, մեկ թերթ, մեկ կոր։

Ռեագենտի ձևի տողն այստեղ հիմնավոր տեղ ունի։ Առևտրային մեթիլեն կապույտը կարող է լինել անջուր աղ կամ հիդրատ, օրինակ՝ տրիհիդրատ, իսկ սխալ մոլային զանգվածն աննկատ շեղում է յուրաքանչյուր անվանական կոնցենտրացիան։ Ելանյութի մաքրության և բնութագրերի ստուգումները ներկայացված են որակի և դասերի ուղեցույցում։

Ստուգեք անկախ հսկիչ ստանդարտով

Տրամաչափարկման կորը երբեք չպետք է ինքն իրեն գնահատի։ Համապատասխանեցումից հետո առանձին կշռված նյութից պատրաստված ելային լուծույթից պատրաստեք մեկ հսկիչ ստանդարտ՝ ընդունված միջակայքի միջնամասին մոտ կոնցենտրացիայով, և չափեք այն որպես անհայտ նմուշ։ Մի քանի տոկոսի սահմաններում համապատասխանությունը հաստատում է պատրաստման ամբողջ շղթան․ անհամապատասխանությունը մատնանշում է ելային լուծույթը կամ նոսրացումները, ոչ թե սարքը։ Հսկիչ ստանդարտի չափումը կրկնեք նմուշների յուրաքանչյուր խմբաքանակի հետ։ Եթե դրա ցուցմունքը փոխվում է, իսկ կորը մնում է անփոփոխ, նմուշներից առաջ կասկածեք աշխատանքային լուծույթներին կամ կյուվետին։ Այս մեկ սովորությունը բացահայտում է աննկատ սխալների մեծ մասը՝ հիդրատի մոլային զանգվածի կիրառում անջուր նյութի շշի համար, տրամաչափարկումը խախտված միկրոպիպետ, սխալ իոնային ուժով պատրաստված բուֆեր։ Հսկիչ ստանդարտի վերականգնման տոկոսը գրանցեք աշխատանքային թերթում՝ թեքության կողքին, որպեսզի հետագայում ընթերցողը տեսնի, որ գիծը ստուգվել է, ոչ թե պարզապես գծվել։

Ոչ գծայնության մեկնաբանումը որպես պատճառի ախտորոշում

Երբ կորը թեքվում է, շեղման ձևը մատնանշում է պատճառը։ Բարձր աբսորբանսի դեպքում դեպի ներքև կորությունը՝ սպեկտրի անփոփոխ ձևով, մատնանշում է սարքը․ հաճախ պատճառը կողմնակի լույսն է, որը բարձր աբսորբանսի ցուցմունքները շեղում է դեպի ցածր արժեքներ։ 610 nm-ի ուսի աճով ուղեկցվող կորությունը մատնանշում է քիմիական վիճակը․ դիմերն ու ավելի բարձր կարգի ագրեգատները կլանում են մոնոմերից տարբեր կերպ։ Զրոյի չբերվող զրոյական նմուշը կամ ժամանակի ընթացքում նվազող ստանդարտների ցուցմունքները մատնանշում են տարան՝ ադսորբցիա ապակու կամ կյուվետների վրա, հատկապես եթե չափումների շարքում շփման տևողությունները տարբեր են եղել։ Իսկ կետերով անցնող հստակ ուղիղ գիծը, որը, այնուամենայնիվ, տալիս է նմուշների սխալ արդյունքներ, մատնանշում է մատրիցը․ նմուշները տարբերվում են տրամաչափարկման ստանդարտներից, ուստի վերակառուցեք կորը նմուշի մատրիցում կամ անցեք ստանդարտի ավելացման մեթոդին։ Բոլոր դեպքերում կառուցեք մնացորդների՝ կոնցենտրացիայից կախվածության գրաֆիկը։ Պատահական ցրվածությունը հաստատում է ուղիղ գծի մոդելը․ ժպիտի կամ խոժոռված դեմքի նման կորությունը հերքում է այն ավելի հուսալիորեն, քան R քառակուսու որևէ շեմ․ այս դրույթը վավերացման ուղեցույցը բացահայտորեն հաստատում է։

Մեթիլեն կապույտի հետ այս կարգապահությունը տալիս է իր արդյունքը։ Նրա մոնոմերային գոտին ուժեղ է, քիմիական վարքը՝ լավ ուսումնասիրված, իսկ խախտումները դրսևորվում են սպեկտրում՝ նախքան թվերը աղավաղելը։ Կորը կառուցեք նեղ միջակայքում, զրոյական նմուշը ընտրեք պատշաճ կերպով, կրկնությունները պատրաստեք անկախ և թող սպեկտրների ձևը որոշի միջակայքը։ Ստացված գիծը կարճ է, բայց դրա յուրաքանչյուր կետը հավաստի է։

Այս հոդվածի ցուցադրական հաշվարկներում մեթոդը ներկայացնելու համար օգտագործված են հորինված թվեր։ Չափված տեղեկատու գործակիցներն ամբողջական պայմաններով ներկայացված են հղված սպեկտրային տեղեկատուում, իսկ հիմքում ընկած ագրեգացման ուսումնասիրությունը ինդեքսավորված է PMID 33251415 գրառմամբ։