Մեթիլեն կապույտը ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի ներկման համար․ կիրառություններ գելերում և մեմբրանների վրա

Ուսանողը կատարում է ագարոզային գելի էլեկտրոֆորեզ, ներկում այն մեթիլեն կապույտով և ոչինչ չի տեսնում այնտեղ, որտեղ սպասում էր վառ շերտի։ Հարևան աշխատատեղում հետդոկտորական հետազոտողը նույն կապույտ շշով ներկում է Northern բլոտի մեմբրանը և երեք րոպեում ստանում հստակ ռիբոսոմային շերտեր։ Ուսանողը եզրակացնում է, որ գելի փորձը ձախողվել է։ Գելի փորձը չի ձախողվել։ Երկու խնդիրները տարբեր էին, և նույն ներկանյութը դրանց պատասխանում է տարբեր զգայունությամբ, տարբեր ֆոնով և հետագա քայլերի տարբեր կանոններով։

ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի ներկումը մեթիլեն կապույտով ունի ընդհանուր քիմիական հիմք, բայց ոչ ընդհանուր նպատակ։ Գելում ներկանյութը ցույց է տալիս, թե որքան նուկլեինաթթու կա ծակոտկեն մատրիցի ներսում։ Մեմբրանի վրա այն ցույց է տալիս՝ արդյոք փոխանցումը հաջողվել է, և արդյոք նմուշների քանակները հավասար են եղել բոլոր ուղիներում։ Երբ այս տարբերությունը պարզ է, հասկանալի են դառնում նաև արձանագրությունները, հայտնաբերման սահմանները և համատեղելիության սահմանափակումները։

Կարճ պատասխանը

Մեթիլեն կապույտը հարթ կատիոնային ներկանյութ է, որը նուկլեինաթթուներին կապվում է ոչ կովալենտորեն և դարձելիորեն՝ ֆոսֆատների նկատմամբ էլեկտրաստատիկ ձգողության, հիմքերի զույգերի միջև ինտերկալացիայի և փոքր ակոսի հետ կապման համակցությամբ։ Հենց այդ դարձելիությունն է կարևոր։ Շերտերը կարելի է ներկել, դիտել տեսանելի լույսով, գրանցել պատկերը, ապա հեռացնել ներկը կամ մաքրել նմուշը՝ կլոնավորման, հիբրիդացման կամ զոնդով կրկնակի հետազոտման համար։

Ագարոզային գելում երկշղթա ԴՆԹ-ն մեթիլեն կապույտով ներկելու ստանդարտ արագ բաղադրատոմսը ջրում 0.02 տոկոս w/v լուծույթն է՝ 200 միկրոգրամ մեկ mL-ում, մոտ 15 րոպե ներկում և մոտ 15 րոպե ջրով գունազրկում՝ սպիտակ լույսի լուսատուի վրա դիտմամբ։ Մեմբրանների համար Northern բլոտի դասական բաղադրատոմսը 0.02-ից 0.04 տոկոս ներկանյութն է նատրիումի ացետատում՝ մոտ pH 5.2 պայմաններում․ փոխանցումից և անշարժացումից հետո մի քանի րոպե ներկում, ապա ջրով ողողում և ամբողջական գունազրկում՝ հիբրիդացումից առաջ։ Զգայունությունը համեստ է՝ լավ պայմաններում գելի յուրաքանչյուր շերտում տասնյակներից հարյուրավոր նանոգրամներ, իսկ պահպանողական ուղեցույցները նշում են 0.5-ից 1 միկրոգրամ։ Դա էթիդիումի բրոմիդի և SYBR ներկանյութերի հայտնաբերման սահմաններից մի քանի կարգով բարձր է։ Մեմբրանների վրա առանձին տրանսկրիպտի հայտնաբերման համար մեկ օգտակար սահման չկա, քանի որ ներկումը հիմնականում ցույց է տալիս առատ ռիբոսոմային ՌՆԹ-ն և ներմուծված նյութի ընդհանուր քանակը։ Այս բաղադրատոմսերից ոչ մեկում մի օգտագործեք մանրածախ վաճառվող հավելման լուծույթը որպես փոխարինող։ Վավերացված մեթոդները ենթադրում են անալիտիկ մաքրության ներկանյութ, սահմանված բուֆերներ և, ՌՆԹ-ի հետ աշխատելիս, ՌՆազներից զերծ աշխատանքային պայմաններ։

Ինչպես է տեղի ունենում կապումը, և որտեղ այն կարող է մոլորեցնել

Օգտակար մոդելն ունի երեք մաս։ Նախ՝ դրական լիցքավորված օղակային համակարգը ձգվում է դեպի բացասական լիցքավորված ֆոսֆատային կմախքը։ Սպեկտրոսկոպիական հետազոտություններում ցածր աղայնության պայմաններում այս էլեկտրաստատիկ բաղադրիչը գերակշռում է, մինչդեռ մոդելավորումն ու մոլեկուլային դինամիկան ինտերկալացիան և փոքր ակոսին կապումը հաստատում են որպես երկշղթա ԴՆԹ-ի հետ կապման կայուն ձևեր, ինչպես ամփոփված է մեթիլեն կապույտի՝ ԴՆԹ-ին կապման սպեկտրոսկոպիական հետազոտությունում։ Երկրորդ՝ կա որոշակի նախապատվություն GC-ի նկատմամբ․ մոդելավորումը նպաստավոր է համարում CpG և GpC քայլերը, իսկ փորձերը հայտնում են GC-ով հարուստ դուպլեքսների հետ նախընտրելի կապման մասին՝ մեթիլեն կապույտի ինտերկալացիայի նախապատվությունների վերաբերյալ աշխատանքում, սակայն AT դուպլեքսները նույնպես կապվում են։ Սովորական ներկումը հաջորդականության նկատմամբ յուրահատուկ չէ։ Երրորդ՝ միաշղթա ԴՆԹ-ն և ՌՆԹ-ն կապվում են հիմնականում էլեկտրաստատիկ փոխազդեցություններով և հասանելի հիմքերի ու դուպլեքսային հատվածների հետ ստեկինգային փոխազդեցություններով, ինչի պատճառով ներկման ուժգնությունը տարբերվում է՝ կախված երկարությունից, հաջորդականությունից և երկրորդային կառուցվածքից։

Սրանից բխում է երկու հետևանք։ Քանի որ կապումը ոչ կովալենտային է, ներկանյութը լվացվելով հեռանում է։ Պոլիակրիլամիդային շերտերն արագ խամրում են, եթե հատուկ չեն ֆիքսվում, և մշտական ֆիքսման առանձին տարբերակ գոյություն ունի հենց այն պատճառով, որ սովորական ներկումը ժամանակավոր է, ինչպես նկարագրում են Սոտոն և Դրեյփերը PAGE գելերի համար։ Քանի որ ներկանյութը լուսազգայունացնող նյութ է, ներկված ԴՆԹ-ի երկարատև ուժեղ լուսավորումը թթվածնի առկայությամբ կարող է օքսիդացնել գուանինը և ի վերջո առաջացնել շղթաների միաշղթա խզումներ․ այս մեխանիզմը մանրամասն ներկայացված է մեթիլեն կապույտով լուսազգայունացված գուանինի օքսիդացման վերաբերյալ աշխատանքում։ Սպիտակ լույսով կարճատև դիտումը խուսափում է էթիդիումի բրոմիդով դասական ընթացակարգերի հայտնի ուլտրամանուշակագույն վնասումից, և այդ առավելությունն իրական է նյութի նախապատրաստական անջատման համար։ Տեսանելի լույսն ավելի մեղմ է, բայց անվնաս չէ։ Եթե ԴՆԹ-ն հետագայում կլոնավորվելու է, լուսավորումը կարճ պահեք։ Այս զգուշության հիմքում ընկած ավելի լայն լուսաքիմիայի մասին տե՛ս մեթիլեն կապույտի լուսաքիմիայի երկու ուղիները։ Օքսիդավերականգնման զույգի և լիցքային վիճակների մասին, որոնք բացատրում են, թե ինչու է օքսիդացված ձևը կապվում, իսկ վերականգնվածը՝ ոչ, տե՛ս մեթիլեն կապույտի կառուցվածքի և հատկությունների քիմիան։

Առաջին խնդիրը․ ներկում գելերի ներսում

Գելի ներկումը պատասխանում է մեկ հարցի․ այս շերտում կա՞ բավարար նուկլեինաթթու՝ այն անզեն աչքով տեսնելու համար։ Ագարոզում երկշղթա ԴՆԹ-ն ամենալավ ուսումնասիրված դեպքն է։ Ֆլորեսի և գործընկերների՝ մեթիլեն կապույտով գելի ներկման սկզբնական մեթոդը վավերացրել է 0.02 տոկոսանոց արագ արձանագրությունը 1 տոկոսանոց ագարոզի վրա և ցույց տվել հետագա հաջող անջատումն ու կլոնավորումը։ Մատակարարի նույն արձանագրությունը ներկայացված է IBI Scientific-ի մեթիլեն կապույտի արտադրանքի էջում, որտեղ մեմբրանների 0.04 տոկոսանոց բաղադրատոմսը և գելի արագ տարբերակը նշված են կողք կողքի։

Գործնական ընթացակարգը․

1. Կատարեք գելի էլեկտրոֆորեզը սովորական ձևով։ Ներկեք էլեկտրոֆորեզից հետո, ոչ թե դրա ընթացքում, եթե փոփոխված մեթոդի համար փոխանցումը կամ բաժանման ունակությունը չեն վավերացվել։
2. Ընկղմեք թորած ջրում պատրաստված 0.02 տոկոս w/v մեթիլեն կապույտի լուծույթի մեջ՝ մեղմ շարժմամբ, մոտ 15 րոպե։
3. Գունազրկեք՝ մի քանի անգամ փոխելով ջուրը, ընդհանուր մոտ 15 րոպե, մինչև մատրիցի ֆոնը նվազի, և շերտերը հստակ առանձնանան։
4. Անմիջապես լուսանկարեք սպիտակ լույսի լուսատուի վրա։

Ագարոզն ու պոլիակրիլամիդը տարբեր կերպ են գործում։ Ագարոզը ներկանյութը պահում է մատրիցում, ուստի դանդաղ քայլը գունազրկումն է։ Բարակ պոլիակրիլամիդային գելերն արագ են ներկվում, բայց նաև արագ կորցնում են ներկանյութը, ինչը նպաստում է նախապատրաստական կտրմանն ու անջատմանը, բայց խանգարում է արխիվային գրանցմանը։ Պոլիակրիլամիդում սինթետիկ օլիգոնուկլեոտիդների տեղը կարելի է որոշել նույն 0.02 տոկոսանոց բաղադրատոմսով՝ 20-ից 30 րոպեում, ջրով կրկնակի լվացումներով, հետևելով Current Protocols-ի ոճի հաստատված PAGE մեթոդներին։ Նախապատրաստական օլիգոնուկլեոտիդների համար նկարագրվել են նաև շատ նոսր տարբերակներ՝ մոտ 0.0002 տոկոս, նոսր TBE-ում մի քանի ժամ տևողությամբ, սակայն դրանց ապացուցողական հիմքն ավելի թույլ է։

ԴՆԹ-ի և ՌՆԹ-ի տարբերությունը կարևոր է։ Երկշղթա ԴՆԹ-ն ապահովում է ամենաուժեղ կառուցվածքային կապումը։ ՌՆԹ-ն և միաշղթա ԴՆԹ-ն ներկվում են, բայց ավելի թույլ և պակաս կանխատեսելի կերպով։ Ֆորմալդեհիդային ագարոզային ՌՆԹ գելերի դեպքում լաբորատորիաների մեծ մասը բաց է թողնում գելի ներսում կապույտ ներկումը և նախ ՌՆԹ-ն փոխանցում է մեմբրանի վրա, ապա ներկում այնտեղ։ Այդ քայլը թույլ գելային ազդանշանը փոխարինում է ավելի հստակ մեմբրանային ազդանշանով և ներմուծված քանակի գրանցմամբ։

Երկրորդ խնդիրը․ ներկում մեմբրանների վրա

Մեմբրանի ներկումը պատասխանում է այլ հարցի․ փոխանցումը հաջողվե՞լ է, և ուղիները համեմատելի՞ են։ Դասական կիրառությունը Հերինի և Շմիդտի դարձելի Northern բլոտի ներկումն է․ սկզբնական տարբերակում՝ 0.04 տոկոս ներկանյութ 50 mM նատրիումի ացետատում, pH 5.0 պայմաններում, 2-ից 3 րոպե՝ ջրով ողողմամբ, իսկ հիբրիդացումից առաջ ներկը հեռացվում է SSPE-ում նոսր SDS-ով։

Լայնորեն օգտագործվող ժամանակակից տարբերակն իրականացվում է այսպես․

1. ՌՆԹ-ն կամ դենատուրացված ԴՆԹ-ն փոխանցեք նեյլոնի կամ նիտրոցելյուլոզի վրա, ապա անշարժացրեք ուլտրամանուշակագույն խաչաձև կապակցմամբ կամ ջերմային մշակմամբ, որպեսզի ներկման ընթացքում նմուշը չկորչի։
2. Ընտրովի, բայց տարածված քայլ․ մեմբրանը մոտ 15 րոպե թրջեք 5 տոկոսանոց քացախաթթվի մեջ։
3. Ներկեք 5-ից 10 րոպե՝ 0.02-ից 0.04 տոկոս մեթիլեն կապույտով՝ 0.3-ից 0.5 M նատրիումի ացետատում, մոտ pH 5.2 պայմաններում։
4. Ողողեք և գունազրկեք ջրով 5-ից 15 րոպե, գրանցեք պատկերը, ապա հիբրիդացումից առաջ հեռացրեք մնացորդային ներկանյութը։

Northern աշխատանքներում գերակշռում է դրական լիցքավորված նեյլոնը։ Նիտրոցելյուլոզը նույնպես գործում է նույն՝ քացախաթթվի և ացետատի ընթացակարգով։ Պատկերն օգտագործվում է փոխանցումը հաստատելու, 28S և 18S շերտերը համեմատելու համար՝ կամ 23S և 16S-ը բակտերիային ՌՆԹ-ի դեպքում, չափային սանդղակներն ու ստանդարտները նշելու և ընդհանուր ՌՆԹ-ի մոտավոր նորմալացման գրանցում պահելու համար։ Հրապարակված Northern մեթոդներում ներմուծված քանակը ստուգելու համար քանակապես գնահատվում են ներկված ռիբոսոմային շերտերը, այդ թվում՝ կաթնամթերքի գիտության մի աշխատանքում, որն օգտագործել է մեթիլեն կապույտով ներկված ռիբոսոմային շերտերը նորմալացման համար։ Southern մեմբրանները կարելի է տեսանելի դարձնել նույն կերպ, սակայն ներկանյութը շատ ավելի հաստատված է որպես Northern-ի ներմուծված քանակի և փոխանցման ստուգման միջոց, իսկ Southern-ի ԴՆԹ-ն փոխանցումից առաջ դենատուրացվում է, ուստի գելերի զգայունության թվերը չեն կարող ուղղակիորեն կիրառվել այստեղ։

Հայտնաբերման սահմանները և ֆոնը․ որտեղ կապույտը զիջում է

Ստորև բերված համեմատությունը միտումնավոր մոտավոր է։ Ներկման արդյունավետությունը կախված է գելի տոկոսային պարունակությունից, շերտի լայնությունից, օպտիկայից և գունազրկման ճշգրիտ կատարումից։ Յուրաքանչյուր թիվ դիտարկեք որպես մեծության կարգ, ոչ թե տեխնիկական բնութագիր։

Ֆոնի վերահսկումն է որոշում՝ արդյոք համեստ ազդանշանն օգտագործելի է։ Ազատ ներկանյութն ինտենսիվ գունավորված է, ուստի հակադրությունը ստացվում է չկապված ներկանյութը հեռացնելով՝ առանց կապված ներկանյութը հեռացնելու։ Ավելի խտացված ներկանյութը հազվադեպ է բարձրացնում զգայունությունը։ Այն հիմնականում երկարացնում է գունազրկման ժամանակը։ Կատարեք նոսրացումների շարք հենց օգտագործվող գելի, մեմբրանի և տեսախցիկի պայմաններում և օգտագործեք միայն այն միջակայքը, որտեղ ինտեգրված խտությունը համամասնական է մնում ներմուծված քանակին։ Մեթիլեն կապույտը թույլ է տալիս ներմուծված քանակի կիսաքանակական նորմալացում։ Այն լայն դինամիկ միջակայքով քանակական թեստ չէ, քանի որ մեմբրանի տարողությունը, փոխանցման արդյունավետությունը, հագեցվածությունը և գունազրկումը տարբեր են ուղուց ուղի։

Համատեղելիության սահմանները․ ինչն է պահպանվում ներկումից հետո

Կապույտ ներկումից հետո կլոնավորման հնարավորությունը ցուցադրված է։ Ֆլորեսը և գործընկերները կտրել են ներկված ագարոզային շերտերը, անջատել ԴՆԹ-ն, ապա կատարել դրա լիգացումն ու տրանսֆորմացիան՝ հաղորդելով ավելի լավ կլոնավորում, քան էթիդիումի բրոմիդից և ուլտրամանուշակագույն լուսավորումից հետո։ Հավանական պատճառը ավելի քիչ լուսավնասումն է, ոչ թե ներկանյութի ինքնուրույն օգտակար ազդեցությունը։ Սպիտակ լույսի ազդեցությունը կարճ պահեք և անջատված ԴՆԹ-ն մաքրեք գելից անջատման սովորական ընթացակարգով։

PCR-ի և սեքվենավորման համար ապացույցներն ավելի սահմանափակ են։ Մնացորդային ներկանյութը կապվում է նուկլեինաթթուներին, ուստի ֆերմենտային քայլերից առաջ գունազրկեք և մաքրեք նմուշը։ Ակնկալվում է, որ կապույտ գելից պատշաճ մաքրված ԴՆԹ-ն կաշխատի, սակայն տարբեր պոլիմերազների և սեքվենավորման քիմիական համակարգերի հանդուրժողականությունը ներկանյութի ուղղակի մնացորդային անցման նկատմամբ լավ քանակապես գնահատված չէ։ Դա մի ընդունեք որպես տրված փաստ։

Բլոտի հիբրիդացումը համատեղելի է, երբ հերթականությունը խիստ պահպանվում է․ փոխանցում, անշարժացում, ներկում, պատկերի գրանցում, գունազրկում, հիբրիդացում։ Այդ հաջորդականությունն է Հերինի և Շմիդտի մեթոդի հիմքը։ Փոխանցումից առաջ ներկելը կամ գունազրկումը բաց թողնելը այլ մեթոդ է և պահանջում է առանձին վավերացում։ Ներկանյութը հեռացնելուց հետո զոնդի ստանդարտ հեռացումն ու նոր զոնդով կրկնակի հետազոտումն ընթանում են սովորական ձևով։ Նույն ներկանյութերի ընտանիքով բջջային մակարդակի ներկման և այն մասին, թե ինչու ֆիքսված պատրաստուկների տրամաբանությունը չի կիրառվում կենդանի բջիջների մեթոդներում, տե՛ս մանրադիտակային ներկման ատլասը։

Շերտերի կտրումն աշխատում է նախապատրաստական ագարոզի և կապույտով տեղորոշված PAGE օլիգոնուկլեոտիդների համար, եթե խուսափում եք մշտական ֆիքսման տարբերակից։ Գունազրկումից հետո էլեկտրաէլյուցիան քիմիական առումով հավանական է դարձելի կապվող նյութի դեպքում, սակայն հենց մեթիլեն կապույտի համար ելքի վերահսկվող տվյալները սակավ են։ Էլյուցիայից հետո աղազրկեք կամ նստեցրեք նմուշը։

Կրկնվող ձախողումներ

Գելի թույլ շերտերը սովորաբար նշանակում են գունաչափական ներկման համար չափազանց փոքր զանգված, հատկապես կարճ միաշղթա կամ ՌՆԹ թիրախների դեպքում։ Ներմուծեք ավելի մեծ քանակ, օգտագործեք թարմ ներկանյութ, նախ երկարացրեք ներկման ժամանակը, ապա միայն բարձրացրեք կոնցենտրացիան, և ավելի շուտ դադարեցրեք գունազրկումը։ Ամբողջովին կապույտ, առանց հակադրության գելը սովորաբար նշանակում է չափից ավելի ներկում կամ ջրի անբավարար փոխարինում։ PAGE-ի խամրող շերտերը սպասելի քիմիական երևույթ են, ոչ թե ձախողված ներկում։ Արագ լուսանկարեք։ Մեմբրանի անհավասար ֆոնը հուշում է ծալքերի, պղպջակների, մատնահետքերի, անհավասար շարժման կամ տեղ-տեղ կատարված փոխանցման մասին։ Առանց հիբրիդացման վերահսկիչի դա մի մեկնաբանեք որպես ներմուծված քանակների անհավասարություն։ Թույլ, աղավաղված ռիբոսոմային պատկերը կարող է նշանակել քայքայում, բայց նաև ոչ ամբողջական փոխանցում, ընդհանուր ՌՆԹ-ի չափազանց փոքր քանակ՝ սովորական ուղիները պարունակում են մի քանիից մինչև տասնյակ միկրոգրամներ, կամ չափից ավելի գունազրկում։ Ներկանյութը ցույց է տալիս առատ ռիբոսոմային ՌՆԹ-ն։ Այն չի ցույց տալիս հատուկ տրանսկրիպտ։ Դա զոնդի գործն է։

Անվտանգություն և աշխատանք՝ առանց չափազանցված պնդումների

Մեթիլեն կապույտի հետ աշխատելն ավելի պարզ է, քան էթիդիումի բրոմիդի հետ, բայց այն անվնաս չէ։ MilliporeSigma-ի ընթացիկ անվտանգության տվյալների թերթիկը ներկանյութը դասակարգում է որպես բերանով ներթափանցման սուր թունավորության 4-րդ կարգ՝ վնասակար կուլ տալու դեպքում, և պահանջում է հեռացում հաստատված թափոնային ուղով՝ համաձայն Sigma-Aldrich-ի մեթիլեն կապույտի SDS-ի։ Էթիդիումի բրոմիդն ունի ավելի խիստ գենաթունավորության նախազգուշացումներ, այդ թվում՝ սեռական բջիջների վրա ենթադրվող ազդեցությունների մասին՝ իր Sigma-Aldrich-ի էթիդիումի բրոմիդի SDS-ում, իսկ դրա գելերն ու լուծույթները սովորաբար առանձնացվում են որպես վտանգավոր քիմիական թափոններ, ինչպես նշված է Thermo Fisher-ի նուկլեինաթթուների ներկանյութերի ուղեցույցում։ Երկուսի դեպքում էլ հետևեք SDS-ին և հաստատության կանոններին։ Չոր ներկանյութը պահեք ամուր փակված և չոր վիճակում, աշխատանքային ներկանյութը կրկին օգտագործեք միայն արձանագրությամբ թույլատրված դեպքում, ներկված մեմբրանները պահեք չոր՝ ֆիլտրաթղթի թերթերի միջև, իսկ գելերը լուսանկարեք մինչև շերտերը դիֆուզիայի հետևանքով տարածվեն։

Հիշեք աշխատանքային սեղանի համար այս ամփոփումը։ Գելերը ստուգում են տեսանելիությունը մեծ ներմուծված քանակի դեպքում՝ սպիտակ լույսով։ Մեմբրանները ստուգում են փոխանցումն ու ներմուծված քանակը, մինչև զոնդը կատարի բարձր զգայունություն պահանջող աշխատանքը։ Մեկ ներկանյութ ծառայում է երկուսին էլ՝ համեստ զգայունությամբ, դարձելի կապմամբ և գործողությունների խիստ հերթականությամբ։